[发明专利]检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT‑LAMP引物组，所述引物组包含4条引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4所示，本发明还建立了针对CSBV的RT‑LAMP试剂盒，通过对RT‑LAMP条件优化，寻找到了合适的中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT‑LAMP检测条件，该试剂盒具有仪器要求简单、操作简便、高敏感度、高特异性、成本低廉、直接观察结果等特点，尤其适合基层技术人员检测使用，对CSBV真正做到早检测，早预防，确保我国中华蜜蜂蜂群的健康发展，保证区域内野生植物和农作物正常授粉，维持生态平衡。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。

背景技术

蜜蜂囊状幼虫病是一种严重危害幼虫的病毒性疾病，由蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood Virus，SBV)引起。蜜蜂囊状幼虫病毒属于小RNA病毒，目前至少可以感染蜜蜂科的两大蜂种即西方蜜蜂和东方蜜蜂，能感染中华蜜蜂的病毒被称为中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese Sacbrood Virus，CSBV)。此病毒对蜂群危害极其严重，尤其对我国本土蜂种中华蜜蜂危害极其严重；中华蜜蜂为东方蜜蜂一个亚种，对此病毒抵抗力非常弱，极易暴发流行。自从1972年中华蜜蜂囊状幼虫病首次在中国广东爆发至今，此病毒对中华蜜蜂蜂群发展及生产能力造成了严重的影响，导致我国中华蜜蜂的种群数量急剧减少。流行病学调查结果显示，此病目前已成为危害中华蜜蜂种群发展最严重的常发疾病之一。在一些地区，中华蜜蜂囊状幼虫病的发病率高达100％，甚至有些蜂场直接导致蜂群崩溃，当地众多野生植物和农作物的传粉受到了严重的影响，生态环境平衡以及作物收成面临严峻的考验。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的传播大体可以归纳为群内传播、群间传播、蜂场间传播和地区间传播四个途径。开发有效的病毒早期检测技术，做到早发现、早预防、早控制就显得尤为重要。目前生产实践中主要通过观察症状和聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction,PCR)方法等检测CSBV，但是当蜂群出现明显症状时通常就错过了最佳防控时期，具有明显滞后性；一般PCR检测条件要求苛刻，且价格昂贵，不利于基层使用和推广。病毒的早期检测技术对于病害的防控意义重大，因此建立快速、准确、简便、经济的CSBV检测方法迫在眉睫。

环介导等温平衡扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是2000年日本学者Notomi等开发的一种全新的等温核酸扩增方法，其特征为针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。相对于普通的PCR扩增技术而言具有高特异性、高灵敏性、操作简便、结果判定直观等优点，具体如下：反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下一步即可完成，可在短时间内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断。目前针对CSBV的LAMP检测方法仅限于马鸣潇等于2011年证实LAMP可以用于CSBV的检测，实验检测的灵敏度低，效果较差。目前，能够快速、准确、特异、便捷以及经济的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的RT-LAMP引物组和试剂盒尚未见有报道及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速、灵敏、特异的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的发明人通过研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒的编码基因序列设计了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，包含以下四条引物：

F3：5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；

B3：5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；