[发明专利]具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法

说明书

本申请是申请日为2012年4月20日、发明名称为“具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法”的中国发明专利申请201280024852.3的分案申请。

交叉引用

本申请要求2011年4月22日提交的美国临时专利申请No.61/478,355的权益，所述申请通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明通过由国立卫生研究院的国立眼科研究所授予的批准号EY016994-02和EY1018241在政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。

背景

光感受器是视网膜中接收和处理视觉信息，通过光转导将可见电磁辐射转换为超极化反应的第一个神经元。绝大多数遗传视网膜疾病直接导致这些细胞丢失，例如影响视紫红质蛋白折叠的显性突变，或间接导致这些细胞丢失，例如视网膜色素上皮细胞(RPE)中影响视网膜再循环途径的隐性突变。

AAV属于细小病毒科(Parvoviridae)和依赖病毒属(Dependovirus)，其成员需要与辅助病毒例如腺病毒一起协同感染以启动复制，并且AAV在没有辅助病毒时建立了潜伏性感染。病毒体由涵盖具有两个开放阅读框：rep和cap的4.9kb单链DNA基因组的25nm二十面体外壳构成。非结构rep基因编码病毒复制所必需的4种调节蛋白，而cap编码装配成60-mer衣壳外壳的3种结构蛋白(VP1-3)。这种病毒衣壳介导AAV载体克服病毒转导的许多生物屏障的能力—包括细胞表面受体结合、胞吞作用、胞内运输和细胞核中的解包装。

文献

美国专利公布No.2005/0053922；美国专利公布No.2009/0202490；Allocca等(2007)J.Virol.81:11372；Boucas等(2009)J.GeneMed.11:1103。

发明概述

本公开提供了衣壳蛋白改变的腺相关病毒(AAV)病毒体，其中所述AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时，与野生型AAV相比，表现出更强的视网膜细胞感染性。本公开进一步提供了将基因产物递送至个体的视网膜细胞的方法和治疗眼病的方法。

附图简述

图1提供了在氨基酸587之后含有无规七聚物的AAV2的代表性三维模型。

图2描绘了相对于AAV2(左)，AAV27M8变异体(右)的更高水平的玻璃体内转导。

图3提供了视网膜低温切片的代表性荧光图像，显示出由携带GFP基因的7M8，在普遍存在的CAG启动子(左)或光感受器特异性Rho启动子(右)的控制下产生的绿色荧光蛋白(GFP)表达。

图4描绘了在经7M8或载有4个酪氨酸突变(7m8.4YF)的7M8转导后，通过流式细胞术计数的每一百万个视网膜细胞的GFP⁺光感受器细胞。

图5提供了AAV2VP1的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。

图6提供了与不同AAV血清型的AAV衣壳蛋白VP1的AAV2(图5)的氨基酸570-610相对应的氨基酸序列。

图7A-I描绘了基因转移后，Rs1h-/-小鼠视网膜中的结构改进。

图8A-D描绘了RS1基因递送后，视网膜电流图A和B波的功能性救援。

图9A-E描绘了7m8-rho-RS1治疗后10个月时测量的视网膜厚度持续增加。

图10提供了视网膜劈裂蛋白(retinoschisin)的氨基酸序列。

图11提供了脑源性神经营养因子的氨基酸序列。

图12提供了RPE65的氨基酸序列。

图13A-C提供了7m8-rho-RS1构建体的核苷酸序列。

图14提供了外周蛋白-2的氨基酸序列。

图15提供了外周蛋白的氨基酸序列。

图16提供了色素性视网膜炎GTP酶调节因子相互作用蛋白-1的氨基酸序列。

图17A-C提供了AAV衣壳蛋白环IV(GH环)区域的氨基酸序列的比对。插入位点用粗体和下划线示出。

图18A-C提供了具有异源肽插入的AAV衣壳蛋白GH环区域的氨基酸序列的比对。

图19提供了荧光眼底图像，显示在施用携带受连接蛋白36启动子控制的GFP的7m8后9周，灵长类动物中央视网膜中的GFP表达。

定义