[发明专利]一种提高植物甲硫氨酸含量的载体及其构建方法和用途

说明书

本发明提供了一种可提高玉米等植物中甲硫氨酸和/或半胱胺酸含量的表达载体，该载体通过采用Rbcs启动子介导的拟南芥丝氨酸乙酰转移酶基因在作物中的过量表达，使丝氨酸乙酰转移酶完成了维管束鞘细胞特异性表达，从而提高了玉米籽粒中总甲硫氨酸和半胱胺酸的含量，并提高了富含甲硫氨酸的10 kDa‑zein含量和植株中的谷胱甘肽含量。本发明还提供了该载体的构建方法及用途，以及使用该载体培育具有高甲硫氨酸和半胱胺酸含量的转基因玉米的方法。

技术领域：本发明属于植物分子育种领域，具体提供了一种表达载体及其用途和构建方法，该载体可提高植物甲硫氨酸和谷氨酰胺含量。

背景技术：

蛋白短缺包括蛋白含量短缺和营养品质低下，是21世纪全球性的严重问题，在尽快提高作物；品种的蛋白质含量的同时，积极改善蛋白质的氨基酸组成，提高营养价值，具有重要意义。

硫是仅次于氮、磷、钾的植物必需的第4大营养元素，缺硫时蛋白质合成受阻，导致非蛋白氮积累，不仅影响作物生长，而且降低农产品；品质；植物含硫量为0.1％-0.5％，其变幅明显受植物种类、品种、器官和生育期影响。十字花科植物需硫最多，豆科、百合科植物次之，禾本科植物较少。含硫氨基酸如甲硫氨酸(也称蛋氨酸，methionine，Met)、胱氨酸、半胱氨酸(cysteine，Cys)等是合成蛋白质的重要氨基酸；蛋白质中含硫氨基酸的含量与种子萌发、生长和作物品种均有密切关系。其中，蛋氨酸作为人体和单瘤胃动物的必需氨基酸之一，在水稻、小麦、大麦、荞麦、玉米，尤其是豆类和玉米等主要的粮食作物和经济作物中含量极低，是主要的限制性氨基酸，因此提高这些作物蛋氨酸含量显得尤为重要。

蛋氨酸是动物生长所必需的氨基酸之一，在动物生长发育和新陈代谢中需要大量的蛋氨酸参与，而其又是大豆饼粕等饲料原料中最易缺乏的一种氨基酸。作为禽类的第一限制性氨基酸，蛋氨酸可以起到促进家禽生长、改善胴体品质、提高机体免疫力和抗氧化功能等效果。

在以大豆饼粕为饲料时，必需添加人工合成的甲硫氨酸。目前市场供应的饲料级蛋氨酸采取化学合成的方法生产，石油深加工产品是其生产的主要前体原料，国际原油价格的跌涨在一定程度上影响蛋氨酸的价格起伏。随着蛋氨酸应用技术的成熟，添加比例增加，蛋氨酸需求逐年增长。截止2015年1月，全球蛋氨酸供应厂家达到7家，生产工厂达到13座，拟建工厂2座，停产工厂1座。特别是亚洲地区，蛋氨酸厂家供应虽然增加，但在集中度较高的前提下，重大突发性事件仍会造成供应短期缺口，从而导致价格上涨。2014年，蛋氨酸主要由欧洲和北美洲供应。

蛋氨酸人工合成需要量较大，而且由于化学工艺复杂，对环境保护造成威胁，且生产成本较高以及市场需求量大，供不应求，导致价格虚高，提高了饲料养殖家禽的成本。

蛋氨酸作为植物含硫氨基酸，在植物生长发育过程中起重要作用。植物和微生物通过吸收土壤中的无机硫成分，合成仅有的两个含硫氨基酸半胱氨酸和蛋氨酸。植物将吸收的+6硫酸盐还原后，形成半胱胺酸含有-2的硫。植物中，从硫的吸收还原到半胱胺酸的合成需要5种酶来完成，如下所示：

蛋氨酸代谢途径

首先，ATP硫酸化酶生成5’磷酸腺苷酸硫酸(APS)。然后以谷胱甘肽为底

物，在5’-磷酸腺苷酸硫酸还原酶(5'-adenylylsulfate reductase，APR)的作用下，由APS生成亚硫酸盐(SO₃^2-)。

植物中PAPS是其它硫化物的底物，而以PAPS为底物进行硫的还原，就意味着在具有3’磷酸腺苷酰硫酸还原酶(3'-phospho-5'-adenylylsulfate reductase，PAPR)的同时还需要有APS激酶(APK)来完成硫的还原。然后在亚硫酸还原酶作用下生成硫化物(S^2-)，这个过程在大肠杆菌中比较普遍。