[发明专利]融合抗菌肽及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制剂技术领域，尤其涉及一种融合抗菌肽及其应用。

背景技术

近年来，由于抗生素、化学药物的滥用、残留，饲料中抗菌药物的添加等导致细菌 出现耐药性，甚至变异现象。而抗生素治疗对此无效，只能用相应的单克隆抗体进行治疗。 因此寻找一些对细菌具有杀灭作用，而又不造成细菌的耐药性，对环境无毒副作用的生物 治疗制剂势在必行。

抗菌肽(antibacterialpeptides，ABPs)，是生物体在抵抗病原微生物的防御反 应过程中产生的一类具有抗微生物活性的小分子多肽。抗菌肽是动物体液免疫系统中存在 的具有广谱杀菌，对病毒、某些肿瘤、真菌具有一定抑制作用的一类膜活性多肽，是机体天 然免疫系统的重要组成部分。

当前获得抗菌肽的方法主要为天然抗菌肽的提取和基因工程表达。由于抗菌肽为 体内诱导合成，生物体中含量较低，导致从生物体内直接提取的难度大，对技术和成本的要 求高，难以规模化生产；同时抗菌肽一般为阳离子多肽，易被蛋白酶降解，因此表达时通常 添加一些蛋白标签，以提高表达量并可简化分离纯化过程。然而融合蛋白通常需要蛋白酶 或化学裂解将抗菌肽从蛋白标签上切下后才可发挥抗菌作用。这些问题在一定程度上限制 了抗菌肽的大规模应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足而发明的一种融合抗菌肽及其应用。

本发明是这样实现的：一种融合抗菌肽,其特征在于：包括天蚕素cm4和猪源抗菌 肽PR-39。

所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。

所述融合抗菌肽的核苷酸序列如SQEIDNO.2所示。

一种含有融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体。

一种制造上述融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括

步骤1）克隆载体的构建：

1.1根据公布的天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列，以E.coli标准密码子为 参考设计抗菌肽的基因序列；并在基因序列两端分别引入BglⅡ、BamHⅠ同尾酶和XholⅠ 的酶切位点，化学合成的如SEQIDNO.2所示的基因序列；将用BamHⅠ和XholⅠ双酶切合成 的基因序列连接至用BamHⅠ和XholⅠ双酶切的pMD18载体并转化至E.coliDH5α感受态细 胞，得到pMD18-Pocec克隆载体。

1.2将pMD18-Pocec克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18- Pocec克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，将连接产物转化至 E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-2Pocec克隆载体。

1.3将pMD18-2Poce克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18- 2Poce克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，即得到如SEQID NO.3所示的基因序列，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-3Pocec克隆 载体。

步骤2）表达载体的构建：

将pMD18-3Pocec克隆载体和pET-32a载体均用BglⅡ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切 后的pMD18-3Pocec克隆载体、pET-32a载体相连接，得到pET-32a-3Pocec表达载体，将pET- 32a-3Pocec表达载体转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛 选，得到E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec。

步骤3）3Pocec包涵体蛋白的表达：

将E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec按照1：100—1:106的比例接种在含氨苄青霉素 的LB培养基上，37℃培养过夜后再次按照1：100比例接种至含氨苄青霉素的LB培养基，在37 ℃条件下培养至600nm处OD值0.4-0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.2-0.3mmol/L以诱导融 合抗菌肽包涵体蛋白的表达。

步骤4）3Pocec包涵体蛋白的纯化：