[发明专利]融合抗菌肽及其应用

权利要求书

1.一种融合抗菌肽,其特征在于：包括天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39。

2.根据权利要求1所述的融合抗菌肽：其特征在于：所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如 SQEIDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的融合抗菌肽，其特征在于：所述融合抗菌肽的核苷酸序列如 SQEIDNO.2所示。

4.一种含有根据权利要求3所述的融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体。

5.一种根据权利要求1所述的融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括

步骤1）克隆载体的构建：

1.1根据公布的天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列，以E.coli标准密码子为 参考设计抗菌肽的基因序列；并在基因序列两端分别引入BglⅡ、BamHⅠ同尾酶和XholⅠ 的酶切位点，化学合成的如SEQIDNO.2所示的基因序列；将用BamHⅠ和XholⅠ双酶切合成 的基因序列连接至用BamHⅠ和XholⅠ双酶切的pMD18载体并转化至E.coliDH5α感受态细 胞，得到pMD18-Pocec克隆载体；

1.2将pMD18-Pocec克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18- Pocec克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，将连接产物转化至 E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-2Pocec克隆载体；

1.3将pMD18-2Poce克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18- 2Poce克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，即得到如SEQID NO.3所示的基因序列，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-3Pocec克隆 载体；

步骤2）表达载体的构建：

将pMD18-3Pocec克隆载体和pET-32a载体均用BglⅡ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切 后的pMD18-3Pocec克隆载体、pET-32a载体相连接，得到pET-32a-3Pocec表达载体，将pET- 32a-3Pocec表达载体转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛 选，得到E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec；

步骤3）3Pocec包涵体蛋白的表达：

将E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec按照1：100—1:106的比例接种在含氨苄青霉素 的LB培养基上，37℃培养过夜后再次按照1：100比例接种至含氨苄青霉素的LB培养基，在37 ℃条件下培养至600nm处OD值0.4-0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.2-0.3mmol/L以诱导融 合抗菌肽包涵体蛋白的表达；

步骤4）3Pocec包涵体蛋白的纯化：

将步骤3）中加入IPTG诱导的E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec菌体收集后离心，弃 上清，菌体洗涤2—3次后重悬，进行超声破碎；所述超声破碎的条件是：功率250W，工作 5sec，间隔5sec，共20min；然后将破碎后的菌体于离心机温度4℃、12000rpm条件下离心 20min，弃掉上清液，在沉淀中加入含有1%TritonX-100的PBS搅拌洗涤30min，于4℃， 12000rpm离心15min，弃去上清液，重复一次；再用PBS搅拌洗涤一次，于4℃，12000rpm 离心15min，弃去上清液，得到包涵体蛋白沉淀；

步骤5）3Pocec包涵体蛋白的溶解：

将步骤4）中得到的包涵体蛋白沉淀用8M尿素溶解液溶解，并于室温放置30min，然后4 ℃，1500rpm离心30min，留取上清液；

步骤6)3Pocec包涵体蛋白的切割:

将步骤5)得到的上清液中直接加入羟胺切割液，使终浓度为：盐酸羟胺-1.0mol/L， Ches-0.1mol/L，pH9.3（35℃），将混合后的溶液置于35℃水中，水浴中培养8—9h，得到融 合抗菌肽单体溶液，所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。