[发明专利]特异性结合前列腺癌的短肽PCP7及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质多肽技术领域，具体涉及一系列可特异性结合前列腺癌的短 肽。

背景技术

前列腺癌是严重威胁中老年男性健康的恶性肿瘤之一，而且发病率逐年上升，死 亡率高，仅次于肺癌，位居第二。50多年以来，雄激素阻断治疗一直是前列腺癌的标准疗法， 然而，大多数患者最终会发展为激素抵抗性前列腺癌(hormonerefractoryprostate cancer,HRPC)。对于HRPC，目前尚无有效的疗法，而现有治疗手段包括放射治疗、化学治疗 等均不能延长患者生命达一年以上。因此探索新型有效的前列腺癌治疗方法，一直是泌尿 外科临床所面临的重要课题之一。

目前我国对于前列腺癌的筛查率相对较低，这也是造成前列腺癌死亡率偏高的重 要原因之一。因此，本领域迫切需要开发可用于前列腺癌诊断的相关蛋白。而多肽因分子量 小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力而成为靶向传递研究中 的理想配体。然而已知的天然受体-配体对是非常有限的。

噬菌体展示肽库技术的发展则为发现和表征新的配体及对应受体提供了有力的 工具，不仅有望实现临床应用于肿瘤的靶向治疗，也有助于解释疾病发生机制的理论研究。 噬菌体展示技术通过将特定片段插入噬菌体DNA中而将相应的多肽表达在pIII衣壳蛋白 上，从而在噬菌体的DNA和衣壳蛋白之间搭建桥梁，使得各种靶分子的多肽配体可通过体外 或体内筛选得以快速鉴定。发展至今，应用此技术已成功筛选得到针对肝癌、结肠癌、乳腺 癌等多种人类肿瘤的靶向多肽，但是对于筛选前列腺癌靶向配体的相关报道则很少。

因此，本发明利用噬菌体展示肽库技术于前列腺癌肿瘤模型体内筛选得到16条可 靶向前列腺癌的短肽，并对此多肽的靶向特性进行了鉴定，以考察其作为靶向配体用于传 递药物至前列腺肿瘤部位的可行性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一系列利用噬菌体展示肽库技术筛选 得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。

本发明的另一个目的是提供上述多肽在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

用噬菌体展示肽库减性筛选肿瘤细胞特异性结合多肽或靶肽的方法为：通常用两 个细胞系进行筛选，将噬菌体展示随机肽库先通过不含靶抗原的正常细胞筛选，未结合的 上清再通过含靶抗原的细胞，筛选出噬菌体扩增后进行下一轮筛选，最终得到特异性结合 肽。

首先，采用上述噬菌体展示肽库减性筛选技术，以前列腺癌LNCaP和PC3细胞作为 靶细胞，正常细胞为吸附细胞，对NEWENGLANDBiolabs的Ph.D.-7^TMPhageDisplay PeptideLibraryKit进行四轮体外筛选，通过逐轮增强洗涤力度，获得了前列腺癌特异性 的噬菌体克隆。上述的筛选后，分别于第二轮、第三轮和第四轮筛选结果中随机挑取单克隆 进行DNA的提取和测序。应用生物信息学工具分析筛选得到的多肽序列，同时酶联免疫吸附 实验用于分析候选噬菌体单克隆对细胞的结合能力，从而鉴定出与前列腺癌细胞具有较强 的亲和力的噬菌体16个克隆，将该16个克隆送去测序，并分别命名为PCP1-16，测序结果证 实PCP1-16的氨基酸序列分别如SEQIDNO：1-16所示。

本发明筛选得到的多肽经鉴定具有以下特性及优点：

多肽可有效地识别并特异性结合前列腺癌细胞系LNCaP和PC3，而对正常的前列腺 细胞系RWPE-1，及其他肿瘤细胞HepG2、A549、SW480的结合能力弱，表现出针对前列腺癌特 异的识别和结合能力；

该多肽具有分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲 和力的普遍特点，该多肽可用于制备前列腺癌诊断试剂药盒，该试剂盒诊断灵敏度高、特异 性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期临床诊断、以及治疗效果的评价 与病人病情转归、预后的判断。

附图说明

图1为ELISA检测第四轮筛选噬菌体克隆与LNCaP和PC3的亲和力对比柱状图；

其中，图1A为PCP1-20这20个噬菌体克隆分别对LNCaP的亲和力，图1B为PCP1-20 这20个噬菌体单克隆分别对PC3的亲和力，21为原库随机噬菌体克隆对LNCaP的亲和力，22 为原库随机噬菌体克隆对PC3的亲和力。