[发明专利]提升耐热性的植酸酶

说明书

本申请系关于一种提升耐热性的植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。

本申请系关于一种植酸酶，尤指一种提升耐热性的植酸酶。

现有技术

植酸(phytic acid)又称为肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，为植物中储存磷的主要形式，在种子中含量尤其丰富，而种子如谷类及豆类是动物饲料的主要原料。虽然种子中的植酸可成为饲养动物所需磷的重要来源，但只有反刍动物才能代谢植酸以利用其中的磷；对于非反刍动物，不能被消化代谢的植酸反而被视为抗营养物质，是因为植酸带有丰富的负电，易与带有正电的离子，如钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铜离子、铁离子螯合，再与蛋白质及淀粉形成复合物，阻碍消化酵素代谢，影响营养物质及金属离子的消化吸收。此类无法代谢植酸的非反刍动物须在饮食中添加无机磷或添加植酸酶。但添加无机磷的方式不仅成本高，动物排泄物中未被代谢的植酸也会造成水质污染，破坏生态平衡。经由植酸酶在饲料中的添加，则可增加动物对饲料中磷的可利用性达到60％，降低磷酸的抗营养现象，除了提高营养吸收，也能降低磷的排出达50％。

植酸酶是能够从植酸中水解出磷酸根的酵素泛称，在动物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在，植酸酶能够将植酸上的六个磷酸根依序水解出来，不同植酸酶的水解最终程度不一，水解机制也不同，若依此做为分类，植酸酶可分为组氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phophatase)、紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase)、β螺旋桨植酸酶(β-propeller phytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteine phytase)，其中组氨酸酸性磷酸酶因为其最适pH值及作用条件较适合用于饲料添加，因此被广泛的研究。组氨酸酸性磷酸酶催化机制是藉由酸碱反应，将连接肌醇环及磷酸根的磷酸单脂键进行水解作用，释放出磷酸根；水解步骤分为两个阶段，首先组氨酸酸性磷酸酶会利用活性区的组氨酸攻击植酸中的一个磷酸单脂键，形成磷酸-组氨酸中间体，再由活性区的天冬氨酸利用一个水分子提供质子给磷酸-组氨酸中间体中磷酸根的氧离子，释放出一个磷酸根。

尽管植酸酶于饲料添加在动物饲养已显示增加生产力，且使用500-1000单位活性的植酸酶可代替1克的的无机磷添加及减少30-50％磷的排出，但在工业上如何使占有饲料市场60％的植酸酶能具有经济效益，为酵素改造持续的目标及需求。植酸酶在饲料工业的制程及应用上，必须具有在pH 2-6.5高活性，抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性，产品制粒时的耐热性，提高酵素作用时的活性才能降低生产成本。

酵素改造的策略可分为两种，一是利用定向进化，一是利用理论性的设计。定向进化包括两个步骤，一是制造具有丰富多样性的突变基因库，其次再从基因库中筛选具有特定优化特性的突变株。突变基因库的制造方法常用的有易错聚合酶链式反应(error-pronePCR)及DNA重组反应(DNA shuffling)，但庞大的突变基因库需要有大量筛选的方法，否则对于筛选上是相当耗费人力及时间的。近年来，随着可利用的蛋白质结构及序列增加，还有计算机计算软件技术的发展，蛋白质中与底物结合、活性区域、稳定结构的氨基酸可被识别出，因此以此理论基础建立的突变基因库能更有效地筛选出优化的酵素特性。