[发明专利]一种延胡索快速鉴别方法

说明书

本发明公开了一种延胡索快速鉴别方法，通过针对延胡索的一对特征引物，对延胡索进行快速鉴别，该方法包括以下步骤和条件：(1)将收集的各批供试药材取总DNA；(2)取特征引物P2，P4加无菌水稀释；(3)通过PCR反应程序获得扩增产物；(4)扩增产物与6×Loading buffer混匀后点于琼脂糖凝胶上，置于紫外灯下观察，拍照并保存；(5)照片中显示正品延胡索在200～300bp之间有一条清晰条带，其他伪品在该位置均无条带，阴性无干扰。本发明方法属于快速测定方法，基于PCR技术鉴别延胡索，方法简单、准确，灵敏度高，取样量少、稳定性好、检测速度快、特异性强，非常有利于在制药过程中延胡索药材快速质量控制中的应用。

技术领域

本发明涉及中药质量检测的技术领域，特别是涉及一种延胡索快速鉴别方法。

背景技术

延胡索为罂粟科紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎，为著名的“浙八味”之一，具有活血，行气，止痛的功效。由于临床用量不断增加，国内外市场需求量持续加大，导致伪劣混杂，不法商人以次充好，以假冒真。

延胡索伪品来源多为其同属植物，成分有相似，其中全叶延胡索为最常见的代替品和原材料市场上的混淆品。仅仅靠传统的形态分析已不能进行品种的科学鉴定和种源的遗传分析，并且检验时间长，检验成本较高，没有一种可靠有效快速方法可将延胡索与其他伪品区分开来。

发明内容

本发明的目的在于提供延胡索快速鉴别方法，该方法利用特征引物通过PCR技术对延胡索进行快速鉴别，解决制药过程中延胡索药材快速质量控制的问题。

本发明具体的技术方案如下：

一种延胡索快速鉴别方法，包括如下步骤：延胡索快速鉴别方法，其特征在于，通过针对延胡索的一对特征引物的聚合酶链式反应，对延胡索进行快速鉴别，该方法包括以下步骤和条件：

(1)将各批供试药材，经95％乙醇擦拭表面，晾干，用液氮冷冻研磨成粉末，取研碎后的粉末60mg，用DNeasy Plant Mini Kit DNA提取试剂盒提取试剂盒提取总DNA，备用；

(2)取特征引物P2 5'-CTGTGGCCCTCCGGGTTT-3'，P4 5'-GAGTCGCCCCCATCCCTCTAC-3'加无菌水稀释成10μmol/μL，备用；

(3)PCR扩增：50μl体系中含有浓度为10μmol的P2、P4上下游引物各1μL，模版DNA2μL，Prime STAR HS(Premix)聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10s，68℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；获得扩增产物；

(4)取步骤(3)扩增产物5μL，与6×Loading buffer 1.0μL混匀后点于1.5％琼脂糖凝胶上，用1×TAE电泳缓冲液在110V电压恒压电泳20min；

取出凝胶，置于紫外灯下观察，并用CAMAG成像系统拍照并保存；

(5)步骤(4)所得照片中显示，正品延胡索在200～300bp之间有一条清晰条带，其他伪品在该位置均无条带，阴性无干扰；

(6)对步骤(1)～(5)进行耐用性考察：分别考察DNA聚合酶、PCR仪对该延胡索快速鉴别方法的影响，分别更换DNA聚合酶为Taq聚合酶，更换PCR仪为荧光定量PCR仪。

本发明具有如下优点及用途，本发明延胡索快速鉴别方法能够简单、准确、直接地鉴别延胡索，只需微量的用量即可检测，并具有灵敏度高，稳定性好，特异性强的特点，用于制药过程中延胡索药材快速质量控制。

下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。