[发明专利]猴B病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原技术领域，具体涉及一种猴B病 毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。

背景技术

猴B病毒也称为猴疱疹病毒(Herpesvirussimian)，是一种人畜共患病原，自然宿 主是猕猴。猴感染B病毒后只引起局部或无症状感染，类似于人感染单纯疱疹病毒，而人感 染后则会导致脑炎、脑脊髓炎，严重时致呼吸麻痹死亡。对实验室工作人员的调查表明，至 今已有43例人感染B病毒的报道，虽然数目不高，但死亡率大于70%，幸存者会留下神经后遗 症。2002年颁布实施的国家标准，已将B病毒列入普通级实验用猴应排除的病原微生物。在 我国，猴子资源丰富，流动性较强。每年不仅有一定数量的猕猴、食蟹猴等出口欧美地区，而 且也从东南亚地区进口一定数量的猴子，因此对进出口猴子B病毒的检测，一直是检验检疫 工作的重要任务之一。目前针对B病毒的检测方法主要有病原分离、分子生物学检测方法和 血清学检测。在病原学检测方面：由于B病毒是生物安全四级病原微生物，其培养需在生物 安全四级实验室进行，因此病原分离检测仅在国家规定的特定实验室进行。在分子生物学 检测方面，虽然PCR方法可用于猴群的质量监测，但多数情况下不能检出病毒核酸的存在， 原因是B病毒像其他α疱疹病毒一样，感染后会在宿主神经节建立潜伏感染并很少活化。所 以抗体检测是判断猴是否感染B病毒的重要依据。

免疫梳方法是能够对病毒血清抗体进行定性、定量检测的一项新型体外诊断技 术，这种技术突破性地将病毒抗原点布在具有极强蛋白吸附力的硝酸纤维膜上，把包被好 的抗原膜贴附于PVC板以增加膜的强度和硬度，经机器裁切制成免疫梳。将此免疫梳插入稀 释好的待检血清样本时，特异性抗体与抗原结合并固着于膜上，再通过酶标二抗底物反应， 染色后，抗体阳性的样本表现为肉眼可见的红色斑点，阴性则无颜色变化。膜经过图像处理 系统数据化后可以进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猴B病毒 抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

1、一种用于构建猴B病毒抗体的免疫梳的SOE-PCR引物组，引物BVF：如序列表SeqNo.1 所示，引物BVR1：如序列表SeqNo.2所示，引物BVR2：如序列表SeqNo.3所示。

2、一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-BV，序列如序列 表SeqNo.4所示。

3、一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-BV的构建方法， 包括如下步骤：

（1）根据猴B病毒的基因序列，设计SOE-PCR扩增引物，引物BVF：如序列表SeqNo.1所 示，引物BVR1：如序列表SeqNo.2所示，引物BVR2：如序列表SeqNo.3所示；

（2）进行SOE-PCR扩增猴B病毒基因；

（3）猴B病毒基因的回收；

（4）克隆质粒pMD18T-BV的构建及测序；

（5）表达载体pGEX-4T-BV的构建，序列如序列表SeqNo.4所示。

4、如上所述的一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-BV的 构建方法，所述的步骤（2）采用SOE-PCR反应的具体步骤如下：

第一轮PCR反应条件：

将混合液在95℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，15 个循环，72℃总延伸10min；

上述混合液如下所示：