[发明专利]一种用于荧光定量PCR检测15型HPV的特异性引物和探针的组合以及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用荧光定量PCR(聚合酶链式反应)技术检测样本中一种或多种高 危型人乳头瘤病毒的定性试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种严重危害人类健康，引起人类多 种疾病的常见病原体，它的存在与多种皮肤黏膜增生，特别是宫颈癌的发生、发展密切相 关。HPV是一种嗜上皮性的双股环形DNA病毒，其颗粒呈球形，二十面体对称，直径为 45～55nm，基因组全长约8000bp。目前根据基因组中特定区段的差异世界上已发现110多 种HPV的亚型。不同的基因型的HPV具有不同的致病危险性，低危型HPV主要引起肛门 皮肤和外生殖器疣类病变，而高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的重要原因，所以HPV 的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道 肿瘤的癌情预报具有重要意义。

在已经发现的110多种HPV型别中有30多种在宫颈癌中被检测到，世界卫生组织及 国际癌症研究署均已经确认HPV是引起宫颈癌的最主要原因。宫颈癌是一种严重影响妇女 健康的恶性肿瘤，其发病率位居世界女性恶性肿瘤的第2位，而在一些发展中国家和地区 仍居第1位，全世界每年约有50万新发子宫颈癌病例，亚洲约38万，中国约15万例。 99.7％的宫颈癌患者都可以检测到高危型的HPV，HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌。宫颈癌 从一般的癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间，是一种可预防和可治愈的疾病。缺 乏HPV的检测和防治会使HPV感染率增高和年轻化，导致降低宫颈癌的治愈率。因此，准 确可靠的HPV核酸分型检测对宫颈癌的早期诊断和预防有着重要的意义。

HPV早期筛查方法主要分为基于细胞学和基于PCR的方法。在基于细胞学的筛查方法 中目前应用最广的是以巴氏涂片细胞病理学发展出来的TCT(液基薄层细胞技术)。在TCT 中多余的血细胞和炎症细胞会被裂解，由自动细胞处理机将含有约5万个细胞的随机样本 制作成薄层涂片，因此操作更标准化，误差相对较小，然而由于涂片仍然需要人工阅片， 以及取材、染色等因素的影响，仍存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高的缺 点，另外不能对HPV进行分型。

基于PCR的检测方法主要有第二代杂交捕获(HC-II)、反向点杂交(RDB)和荧光定 量PCR(FluorescenceQuantitativePCR，FQ-PCR)。

1.HC-II利用化学荧光检测HPV中的DNA，是美国Digene公司的HPV检测技术，将 线性RNA探针与普通引物的PCR产物杂交。由于使用了混合探针，HC-II可以同时检测多 种高危型HPV，具有较好的敏感性。但是RNA探针稳定性较差，且无法分型，对实验条件 和操作技术的要求较高，容易引起交叉反应并导致假阳性结果。

2.反向点杂交是Saiki等提出的一种技术，首先利用标记了生物素的引物扩增HPV 的靶DNA，然后将PCR产物与固定在尼龙膜或硝酸纤维素膜上的多个探针杂交，经过显色 后便可在同一张膜上分辨出多种HPV亚型。但是反向点杂交的结果同样需要肉眼判断，造 成对结果准确性的影响以及假阴性较高等问题。

3.荧光定量PCR是利用特异性或通用引物对目的片段进行扩增并与特异性荧光标记 的探针杂交或通过荧光染料与PCR产物结合，连续监测探针或荧光染料产生的荧光信号的 变化，通过在PCR指数扩增其间的荧光信号强弱来测定特异性产物的量，从而推断目的基 因的初始量。荧光定量PCR中使用的探针技术主要有Taqman探针、MolecularBeacon(分 子信标)、Scorpion(蝎子)探针、Taqman-MGB探针、Taqman-LNA探针等，Taqman-MGB和 Taqman-LNA探针相比于Taqman探针检测的灵敏度更高，但是价格昂贵，因此本发明希望 采用Taqman探针以较低的成本仍然达到准确检测的目的。

Taqman探针是一条在5’端标记了荧光报告基团和3’端标记了荧光淬灭基团的寡核 苷酸单链，PCR反应前荧光报告基团被荧光淬灭基团淬灭，PCR反应时Taq酶利用外切活 性将5’荧光报告基团切下产生荧光信号荧光信号的强度与PCR产物数量呈正比。