[发明专利]一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法。

背景技术

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上广泛分布且享有盛誉的优良牧草，被称为 “牧草之王”，不仅能改良土壤，还可以增加优质蛋白质，是发展优质高效畜牧业的物质 基础，也是人类有益健康与保健的食用植物之一。

我国苜蓿产业的发展严重受到种质资源的限制，缺乏适应不同地区苜蓿品种的种子， 为了满足现代化畜牧业发展的需要，扩大苜蓿的种植面积，培育、繁殖适应不同生境条件 不同使用目的的苜蓿品种，已成为发展我国苜蓿产业的主要问题之一。

中国苜蓿育种通常采用选择育种、杂交育种、雄性不育系育种、生物技术辅助育种、 航天育种等方法。各种方法均有应用，应用较多的是选择育种和杂交育种。我国目前已选 育出的苜蓿新品种均采用了常规育种技术和方法(引种选择、鉴定筛选、杂交育种)。国 内育成的品种都是采用传统的常规育种技术和方法育成的，普遍采用的是引种驯化、人工 选择、杂交育种、诱变育种、鉴定筛选等育种方法，而细胞诱变、细胞融合、杂种胚培养 等细胞工程现代生物技术在牧草育种中的应用几乎还是空白。利用现代植物组织培养等生 物技术选育出的品种尚未见报道。目前，我国登记的品种当中没有单纯应用生物技术育成 的品种。较多的研究集中于抗性基因的转化与基因表达，以提高苜蓿的抗性。选育适应干 旱、严寒、沙化、盐碱化等不同生态条件的苜蓿品种对保护生态环境、充分利用国土资源、 满足市场对草饲性畜产品的需求有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有常规育种方法得到的苜蓿抗旱性较差，移栽成活率不高 的问题，而提供对干旱具有抗性的苜蓿愈伤组织再分化成芽和根的方法。

本发明抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法按下列步骤实现：

一、将经NaN₃诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织(茎段为外植体)接种于MS固 体培养基中,在23～25℃下培养,每日光照射12h，1000Lx光照强度，培养18～22d(天) 完成1次继代，重复继代培养多次，得到继代培养后的愈伤组织；

二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成块状，然后接种到含有NAA和6-BA 的芽分化MS培养基上，在温度为23～25℃，每日光照射16h，2000～4000Lx光照度的 条件下进行培养，得到分化出芽的苜蓿组织；

三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段，分段后移接到以1/2MS或MS为基 本培养基的生根培养基上，在温度为23～25℃，1000～2000Lx的光照度，每天光照16h 的条件下在培养瓶中进行培养，得到分化出根的无菌苗；

四、当分化出根的无菌苗长到2～3cm并有4～5条粗壮根系时，在培养室内将培养瓶 口打开，进行2～5d的炼苗，然后挑选株高为4～5cm，并有4～5条粗壮根系的幼苗移栽 到营养土中进行培养，完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化；

其中步骤二所述的芽分化MS培养基为MS+2.0mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂；

当步骤三所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基时，生根培养基为1/2MS+0.15 mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L琼脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭；

当步骤三所述的生根培养基以MS为基本培养基时，生根培养基中含有0.05～0.10 mg/LNAA、1.0～1.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、0～2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L琼脂、 0.5g/L的活性炭和15ml铁盐母液，其中所述的铁盐母液是将2～3gFeSO₄·7H₂O和3～ 4gNa₂-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于1L去离子水中得到的。