[发明专利]一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法

权利要求书

1.一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于是通过下列步骤实现：

一、将经NaN₃诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织接种于MS固体培养基中,在23～ 25℃下培养,每日光照射12h，1000Lx光照强度，培养18～22d完成1次继代，重复继代 培养多次，得到继代培养后的愈伤组织；

二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成块状，然后接种到含有NAA和6-BA 的芽分化MS培养基上，在温度为23～25℃，每日光照射16h，2000～4000Lx光照度的条 件下进行培养，得到分化出芽的苜蓿组织；

三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段，分段后移接到以1/2MS或MS为基本 培养基的生根培养基上，在温度为23～25℃，1000～2000Lx的光照度，每天光照16h的 条件下在培养瓶中进行培养，得到分化出根的无菌苗；

四、当分化出根的无菌苗长到2～3cm并有4～5条粗壮根系时，在培养室内将培养瓶 口打开，进行2～5d的炼苗，然后挑选株高为4～5cm，并有4～5条粗壮根系的幼苗移栽 到营养土中进行培养，完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化；

其中步骤二所述的芽分化MS培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+ 10g/L琼脂；

当步骤三所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基时，生根培养基为1/2MS+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+30g/L琼脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L 蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭；

当步骤三所述的生根培养基以MS为基本培养基时，生根培养基中含有0.05～0.10mg/L NAA、1.0～1.5mg/LIBA、0～2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L琼脂、0.5g/L的活性炭 和15ml铁盐母液，其中所述的铁盐母液是将2～3gFeSO₄·7H₂O和3～4gNa₂-EDTA溶于1L 去离子水中得到的。

2.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于步骤一 所述的经NaN₃诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织按下列步骤实现：将苜蓿愈伤组织分 割成块状，然后转入含有浓度为200mg/LNaN₃的液体诱变培养基中进行振荡培养，静止1h 后得到诱变后的愈伤组织，再将诱变后的愈伤组织转入含有8mmol/L的L-Hyp和质量百 分含量为30％PEG的含PEG的MS培养基中进行培养，存活的愈伤组织再转入MS固体培养基 中培养，依次在含PEG的MS培养基和MS固体培养基上培养进行交替筛选。

3.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于步骤一 所述的MS固体培养基为MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D+30g蔗糖+0.8％琼脂,pH＝5.8。

4.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于步骤二 继代培养后的愈伤组织分割成0.5cm³的块状。

5.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于将步骤 二得到的分化出芽的苜蓿组织再转入壮芽培养基中进行培养，壮芽培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂。

6.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于步骤三 所述的铁盐母液是将2.78gFeSO₄·7H₂O和3.73gNa₂-EDTA溶于1L去离子水中得到的。

7.根据权利要求6所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于步骤三 的生根培养基为MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15ml铁盐母液+30g/L 蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭。