[发明专利]一种提取微生物湿菌体胞内维生素K2粗品的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及直接提取微生物湿菌体胞内维生素K₂的方法，通过膜浓缩或离心对微生物发酵液进行菌液分离，然后选用合适的脱 水性有机溶剂对湿菌体进行预处理，再以合适的有机萃取剂对发酵产物进行萃 取，以达到最大的萃取得率，从而获得维生素K₂粗品。

背景技术

天然维生素K₂(Menaquinone，MK，甲萘醌类，VK₂)是一类在动物体内 具有生物活性的脂溶性维生素，化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，MK可 分为14种，以MK-n表示，其中n指C-3侧链上异戊二烯单元的个数。研究表 明，维生素K₂不仅可以促进血液凝固，增加骨钙素合成，而且还可降低患肝癌 和前列腺癌的风险。最近的研究表明，维生素K₂还可用于帕金森氏综合症及肌 肉萎缩性侧索硬化症的辅助治疗。欧盟已将维生素K₂作为一种功能性食品，在 美国，有关VK₂的药用研究也已进入了临床三期阶段。

黄杆菌是一种能够产生具有高生物活性、高生物相容性VK₂的革兰氏阴性 菌。通过研究简单、快捷、高效的萃取方法，对于VK₂的工业化生产和临床应 用，具有重要的经济和社会意义。

根据目前文献报道，分离提取微生物胞内脂溶性发酵产物的方法主要有以 下几种：

1、固-液萃取法

固-液萃取是指溶剂进入固态物料，将有效成分从固相转移到液相的过程。 RobertoE.Armenta等(JAgricFoodChem，2006,54,9752-9758)利用固-液萃取 及超声波辅助法，首先将发酵后的thraustochytridstrainONC-T18菌离心后冻干， 然后通过调节石油醚、丙酮、水的比例(15:75:10)从中提取了类胡萝卜素。但 该方法耗时繁琐，有机溶剂不易回收利用，因而不适于工业化生产。

2、皂化提取法

皂化提取是利用酯(尤指羧酸酯)在碱的作用下水解生成羧酸盐和醇，再 获取所要提取的有机物的方法。李聚海等(农产品加工学刊，2007,3:14-17)首 先将发酵后的菌体离心，然后将湿菌体冻干作为实验材料，之后比较了研磨法、 酸热法、超声波法及反复冻融法对干菌体的破壁效果，选择酸热法作为最佳破 壁方法，最后用皂化法提取根癌土壤杆菌菌体中辅酶Q₁₀，获得了较高的提取得 率。但该法步骤繁多，皂化反应需要较高的温度，皂化过程中存在产物不同程 度的降解，需要加入抗氧化剂，并且皂化后有一定的副产物，增加了后续产物 分离纯化的难度。

3、超临界流体萃取

超临界流体萃取分离技术是利用超临界流体的溶解能力与其密度密切相 关，通过改变压力或温度使超临界流体的密度大幅改变。在超临界状态下，将 超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低 和相对分子质量大小不同的成分萃取出来。MaheshV等(BioprocessBiosystEng， 2012,35:809-816)在将菌体经离心冻干后，用超临界CO₂萃取假单胞菌 (Pseudomonasdiminuta)干菌体中的辅酶Q₁₀,通过Box-behnken实验优化萃取 参数，使萃取得率提高到了96.2％。刘国杰(现代食品科技，2013,29 (6):1346-1349)也是先将菌体离心后再用超临界CO₂萃取深层发酵灵芝真菌 菌丝体中的麦角固醇，在进行了萃取条件优化后，使麦角固醇的萃取量达到了 1.1362mg/g。但是该法所用设备复杂，需要控制的萃取参数繁多，对资金及人员 都有较高的要求。

常见的菌液分离技术如絮凝、离心、过滤(例如谷氨酸发酵中的除菌，发 酵科技通讯，1993,22(4)：19-20；苏氨酸发酵中的菌液分离，发酵科技通讯， 2014,43(4)：43-46)等只是作为一个单独的工艺，并未与之后的工序融合到一 起，尤其是对于将菌液分离工艺与胞内产物萃取工艺相融合的技术工艺更是鲜 见。目前，对于提取微生物湿菌体中维生素K₂，尤其是适合工业化生产的提取 方法，尚未见报道。

发明内容