[发明专利]一种敲除猪DJ-1基因的细胞的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及通过基因敲除培育实验动物品种构建领域，具体涉及一种敲除猪DJ-1基因的细胞的构建方法以及基于该细胞获得DJ-1基因敲除猪的构建方法。

背景技术

帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，多见于老年人，平均发病年龄为60岁左右，以运动迟缓、静止性震颤和肌强直为主要临床特征，病变晚期出现不同程度的非运动功能障碍，如痴呆、抑郁、自主功能缺陷等，严重影响老年人的健康和生活质量。帕金森病的发病机理还不是十分清楚，很多研究显示帕金森病是遗传因素与环境因素等多因素导致的。其中，DJ-1基因的突变可引起早发型常染色体隐性遗传帕金森病。

猪作为重要的农业动物，为人类提供了最主要的肉食来源；作为大型的实验动物，与人类在许多方面都极其相似，如器官大小、解剖结构、生理学特性、代谢特性、神经学等，是人类疾病的理想模型动物和异种器官移植的适宜供体。

基因敲除技术是构建人类疾病模型的一种重要手段，是20世纪80年代发展起来的一种通过一定途径使特定基因失活或缺失的分子生物学技术。传统的基因敲除是建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的，主要是通过同源重组方法将外源基因定点整合入靶基因组的特异位点，从而达到对基因进行定点修饰的目的。此过程一般需要首先构建重组载体(打靶载体)，即把目的基因和与靶基因同源的片段重组到带有标记基因(如neo基因等)的载体。将打靶载体通过一定方式导入胚胎干细胞或其他细胞后，一般需要利用标记基因来筛选阳性的细胞(如用G418筛选能表达neo基因的细胞)。通过显微操作技术可以将阳性细胞转变成为特定基因敲除的动物。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组介导的基因敲除技术外，新的技术和手段逐渐被发现和应用，如ZFNs/TALENs。它们由具有特异性识别DNA序列的锌指蛋白/TALE蛋白和非特异性的FokI核酸酶组成，可特异性地切割DNA片段，造成DNA双链断裂，从而诱发细胞的DNA修复机制。在无外源同源片段存在的情况下，则通过非同源末端连接的方式产生小片段 的插入或缺失；在有外源同源片段存在的情况下，则通过同源重组的方式对基因进行纠正或定点插入。

目前猪胚胎干细胞还未成功获得，而体细胞核移植技术已经成熟，因此，可以先获得基因敲除的体细胞，然后利用体细胞核移植技术获得基因敲除猪。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，具有分化为动物个体各组织器官的潜能，是一种非常适合用于体细胞核移植技术中的核供体细胞，目前已被广泛应用。

在生产基因敲除动物的过程中，人们经常会用到标记基因，但是，标记基因可能会促进新耐抗生素病原体的产生或成为新的致敏原，从而引发基因敲除动物的安全性问题。

发明内容

本发明利用pCAG-GFP质粒与针对DJ-1基因设计的TALENs质粒共转染猪胎儿成纤维细胞，通过多次细胞传代使pCAG-GFP质粒丢失，并且利用96孔板进行单细胞克隆的筛选，每次可获得上百个单细胞克隆，通过基因鉴定，可筛选出多个无外源标记基因的DJ-1基因敲除细胞克隆，从而获得无筛选标记基因的DJ-1基因敲除猪，为研究人类帕金森病提供重要的参考价值。

本发明提供了一种敲除猪DJ-1基因的细胞的构建方法，包括：

1)针对DJ-1基因构建TALENs质粒；

2)用步骤1)得到的TALENs质粒和pCAG-GFP质粒共转染猪胎儿成纤维细胞；优选地，所述猪胎儿成纤维细胞在共转染前复苏并在38.5℃、低氧(5％O₂)、5％CO₂培养箱中培养；

3)将步骤2)共转染过的猪胎儿成纤维细胞通过分选得到单细胞，所述单细胞经传代扩繁后，经过鉴定得到DJ-1基因敲除的细胞。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述TALENs质粒是针对DJ-1基因的外显子2设计的；优选地，所述TALENs质粒的左侧TALEN的识别序列为：SEQ ID NO:1：5’-GGAGACGGTTATTCCT-3’，右侧TALEN的识别序列为：SEQ ID NO:2：5’-GGAGGACTTACTCCAGCT-3’，中间包含BspHI酶切位点SEQ ID NO:3：GTAGATGTCATGAGACG。在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)所述的共转染猪胎儿成纤维细胞是通过电转染的方法实现的。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)所述的分选是通过包括下述步骤的方法实现的：