[发明专利]一种羊巩膜胶原蛋白的提取方法、眼用凝胶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种羊巩膜胶原蛋白的提取方法、眼 用凝胶及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白属大分子蛋白质，其超微结构单位是胶原纤维，由于各型胶原蛋 白的聚合方式不同,决定了它们功能各异。人眼巩膜由细胞外基质及少量细胞 组成，胶原纤维是细胞外基质的重要组成部分，约占巩膜干重的75％。浅层巩 膜胶原纤维的直径为166nm，深层巩膜胶原纤维的直径为100nm。在眼球的不 同部位，胶原纤维束排列的方式不同：在眼球前部近角膜缘处、眼球后部视乳 头周围，包括睫状后短动脉及神经穿入巩膜的部位，胶原纤维束呈环形排列， 少部分呈网状，适于作为力的支点、眼外肌附着；从眼球前部近角膜缘至眼球 后部的近巩膜筛板,胶原纤维束排列的总趋势为前后方向(子午线方向)，其中 后极部巩膜网状纤维较多，有一定的可扩张性。此外，胶原纤维使巩膜具很强 韧性，在对抗眼内压故胶原对于维持眼球形态结构方面起到重要作用。当后极 部胶原蛋白不足时，眼球后极部胶原纤维排列发生紊乱，巩膜会出现韧性降 低，可扩张性增加，对眼球产生不利影响。也就是说，胶原蛋白是维持眼球正 常形态，眼轴正常长度，巩膜正常厚度所不可缺少的重要成分，是防止眼球后 极部巩膜进一步延长，厚度进一步变薄，后巩膜葡萄肿发生的物质。因此，外 源性补充胶原蛋白可以预防近视的进一步发展，对病理性近视的治疗有很大的 帮助。

胶原蛋白是人体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白，其具有低免疫 源性、生物可降解性和促细胞生长等诸多的生物学特性，在临床上可作为药物 载体治疗各种眼病，促进眼角膜上皮损伤的修复和角膜伤口的愈合，是一种良 好的眼用药物制剂。但目前使用的胶原蛋白大多数来自于动物组织、皮肤等的 提取物，如动物的皮、肌腱、软骨、鳞片等，具有传染疾病、引起排斥反应、 分子量大等缺陷。

发明内容

为克服现有技术中眼用胶原蛋白具有传染疾病、引起排斥反应、分子量大 等缺陷问题，本发明利用酶水解-盐提取法，提供了一种从羊巩膜中提取胶原蛋 白制备羊巩膜胶原蛋白眼用凝胶，包括羊巩膜胶原蛋白、硼酸、硼砂、聚乙烯 醇、氯化钠、吐温、注射用水、防腐剂；其中，羊巩膜胶原蛋白的质量分数为 80％～90％，防腐剂的质量分数为0.01％～2％，硼酸和硼砂的质量分数为 0.5％～2％，聚乙烯醇的质量分数为0.5％～2％，氯化钠的质量分数为0.5～ 2％，吐温质量的分数为0.3％～2％，注射用水的质量分数为余量。

其中，所述羊巩膜胶原蛋白的提取方法包括以下步骤：

1)将离体的羊眼球去掉除巩膜以外的其他部分，分离出羊巩膜；

2)将步骤1)中得到的羊巩膜切成羊巩膜片；用生理盐水浸泡清洗羊巩膜 片，去除血清和脂肪后，用蒸馏水漂洗，在无菌环境下晾干，得到羊巩膜干 片；

3)取所述羊巩膜干片，加入胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为羊巩膜干片质 量的10％，放入匀浆机内进行匀浆后，放在磁力搅拌机上搅拌提取24h～26h；

4)用高速冷冻离心机在温度为0～4℃，转速为6000转/min的条件下离心 10～30min，取第一次上清溶液，并得到沉淀；

5)将步骤4)中离心得到的沉淀加入0.5mol/L乙酸悬浮溶解，放在磁力搅拌 机上搅拌提取24h～26h，用高速冷冻离心机在温度为0～4℃，转速为6000转 /min的条件下离心10～30min，取第二次上清溶液；

6)合并所述第一次上清溶液和所述第两次上清溶液，缓慢加入碱性溶液调节 pH值至5，滤掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体粉末，缓慢搅拌，在 4℃下，静置8～14小时形成羊巩膜胶原蛋白原液；

7)将羊巩膜胶原蛋白原液放置于高速冷冻离心机中，在温度为0～4℃，转 速为6000转/min，时间为10～30min的条件下离心，取沉淀，用稀醋酸溶解， 将溶解液装入透析袋中，分别用梯度浓度的乙酸溶液各透析24～26小时，然后 用蒸馏水透析24～26小时，每24～26小时更换透析液两次，得到羊巩膜胶原 蛋白水溶液；

8)将羊巩膜胶原蛋白水溶液在-20℃～-80℃下冷冻干燥，制得到羊巩膜胶原 蛋白。

步骤6)中所述碱性溶液为6mol/L的NaOH或6mol/L的KOH。