[发明专利]一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法

说明书

本发明公开了一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法，包括：肌钙蛋白抗体‑大颗粒荧光颗粒结合物配制；硝酸纤维素膜标记抗体的制备；试剂卡的装配；TNI校准品配制；建立标准曲线；计算出待测样本中肌钙蛋白的含量；所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒包括：硝酸纤维素膜、试剂和校准品。本发明试剂盒的最低检测限可达0.1 ng/ml，满足了临床应用的需求；从样本采集到出具检测结果最快只需10‑15分钟，为患者争取了更多的宝贵时间，可对患者病情进行动态检测。本发明结果相关性好，无显著差异，检测结果准确可靠，在临床上可以替代进口产品使用，大幅降低了检测成本。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法。

背景技术

肌钙蛋白是肌钙蛋白T（TnT）、肌钙蛋白I（TnI）及肌钙蛋白C（TnC）三种亚单位组成，它们是肌肉的主要调节蛋白，由于三者紧密结合与钙有依赖性，由钙的释放来控制肌肉的收缩功能。肌钙蛋白I（TnI）是分布在心肌细胞内(cTnI)，主要调节心肌的收缩，健康人中cTnI的浓度低于20.4pg/ml。 因为特异性高，有较高的敏感性，心肌钙蛋白I（cTnI）成为心肌损伤的高敏感性和高特异性的标志物之一，同时也是判断心肌损伤和危险分级，以及判断预后的重要生化指标。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4~6小时后，开始在血液中升高，升高的 cTnI 能在血液中保持很长时间（6~10 天），这样就提供了较长的检测期。具有较宽的诊断窗：cTnI（4～10天），是维持时间最长的非酶类标志物。 在它们的诊断窗中，cTnI增高的幅度大，要比CK-MB高5～10倍。由于在无心肌损伤时cTnI在血液中含量很低，因此也可用于微小心损伤（MMD）的诊断，这是以前酶学指标所难以做到的。cTnI还具有判断预后的价值，对任何冠状动脉疾患病人，即便ECG或其他检查（如运动试验）阴性，只要cTnI增高，应视为具有高危险性。临床研究表明，cTNI检测在急性的诊断和治疗有很高的价值，可应用外科、内科、急诊科和治疗实验室等众多科室。与目前所应用的诊断指标相比，cTNI在诊断和鉴别诊断心机坏死有独特作用。目前检测cTNI的方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量，常用的方法有：凝胶层析及高效液相色谱分析、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、放射免疫测定Radioimmunoassay，RIA)、免疫发光法和胶体金层析法。其中凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化；ELISA法定量准确性 差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；金标方法虽稳定 性较好，但灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。免疫层析法采用两个抗原特异性抗体分别结合在cTNI的不同位点。一个抗体是用于荧光标记，而另一个则包被在硝酸纤维素上面，在标记过程中，荧光抗体与标本中的肌钙蛋白分子结合形成夹心复合物，此复合物在结合了待测样品的cTnI后流经吸水纤维素膜表面时，会和膜上包被的另一种cTnI抗体结合，并固定于结合处，反应完成后，应用适当的光度计测量光信号，计算结合到膜载体的复合物量。光信号强度与cTNI浓度成正比。应用自有算法建立标准曲线，通过它就可求得全血，血清或血浆中未知的TNI浓度。该方法特异性强，敏感性高，不需要价格昂贵的仪器，适合各种规模医疗机构。免疫荧光快速检测法采用双抗体夹心免疫检测和免疫色谱检测原理，能检测心肌受损后游离肌钙蛋白I。在检测膜上已预先包被了与能够结合血样中cTnI的特异性抗体和该抗体种属对应的抗抗体。标本加入后，当标本中cTnI和标记有免疫荧光颗粒的样品液混合，形成抗原-抗体-荧光标记物复合体，该复合物流经膜表面，被停留在 T线的另一特异性抗体捕获，沉淀形成肉眼可见的色带。同时“C”区也总会出现有抗抗体形成的另一条色带，该色带为内部质量控制。经免疫荧光检测仪获取T和 C线数据，经过预先设置的数学模型，计算出相应检测值，转换成患者血样的cTnI浓度，色带的信号深浅与标本中cTnI的浓度呈正相关。在免疫检测技术中，采用改善的包被技术，利用新的材料以提高检测试剂中载体上连接的与待检标本发生免疫反应的成份的浓度，是提高临床检测产品的灵敏度的重要途径。在免疫荧光侧流技术中，使用的荧光颗粒的尺寸和检测灵敏度有极大相关，目前常用的是150-250nm的颗粒。