[发明专利]一种利巴韦林的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及核苷类产品生物技术生产领域，尤其是一种利巴韦林的制备 方法。

背景技术

利巴韦林(Ribavirin)为鸟苷、次黄嘌呤核苷类似物，是一种广谱抗病 毒药物，对多种DNA和RNA病毒均有较好抑制作用。具有作用位点多、不易产 生耐药性、疗效高、毒性低，副作用小等特点，现已用于多种病毒的治疗。 在临床上用于治疗丙型肝炎病毒、呼吸道合孢病毒和拉沙热病毒感染。目前 利巴韦林的工业化生产方法主要有微生物发酵法、酶法以及化学合成法。发 酵法存在着生产周期长、容易污染杂菌、利巴韦林提取工艺复杂以及能耗高 等缺点。化学合成法，反应条件苛刻，周期长，需要进行异构体的分离，成 本居高不下，而且容易造成环境污染，所以，在工业化生产中受到一定的限 制。酶法克服了发酵法和化学法的不足，同时生产成本较低，因而是较为有 效的工业化生产方法。

其中，可以作为酶法合成利巴韦林的起始原料有鸟苷、肌苷、腺苷、胞 苷或尿苷等。由于目前市场上鸟苷的生产成本较低，而且鸟苷作为反应底物 时的分解产物为鸟嘌呤，它的溶解度极低(几乎不溶于水)，使得整个反应平 衡倾向于利巴韦林的合成方向，因而可以得到更高的底物转化率。而未反应 的底物鸟苷可以被离心后重新利用，反应副产物鸟嘌呤则可以用作药物阿昔 洛韦的原料，所以鸟苷经常作为反应底物，选择PNPase作为催化剂。

酶或细胞作为催化剂由于易失活、难以反复使用、不易保藏，限制了工 业化应用。全细胞固定化技术与游离酶和细胞催化相比具有很大优势。细胞 固定化避免了的酶的提取过程，操作相对容易，并且具有更高的操作稳定性。 细胞固定化的方法有很多种，适用于细胞固定化的方法主要有包埋法，吸附 法，交联法等，其中包埋法是最为常用的方法。由于细胞被固定化，减少了 转化液中由游离细胞裂解产生的蛋白，降低了提取的困难，减少了提取成本。

在现有技术的基础上，研究一种高纯度利巴韦林的制备方法具有非常重 要的生产实践价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种利巴韦林的制备方法，利用酶 催化法合成利巴韦林并对利巴韦林分离提取。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

本发明所用的利巴韦林生产菌，是将以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168(ATCC23857))基因组为模板扩增表达的PNPase基因pupG(核苷酸序 列为序列表<400>1所示序列)，与pET-His质粒连接转入Escherichiacoli BL21(DE3)(CICC23796)中，获得的大肠杆菌重组菌BL21/pET-His-pupG。

一种利巴韦林的制备方法，具体方法为：

(1)以基因工程菌BL21/pET-His-pupG为菌种，使用发酵罐培养，获得 细胞；

(2)使用明胶包埋细胞，制成固定化重组表达PNPase的全细胞作为催 化剂，经酶促反应得到利巴韦林转化液；

(3)利巴韦林转化液提取

a.对利巴韦林转化液8000r/min离心5-10min，获得上清液，将上清 液加热至60-80℃，使用1-2％的活性炭脱色20-40min，过滤得滤清液；

b.将滤清液减压蒸发浓缩至1/4-1/3，在0-4℃结晶10-12h，过滤析 出的鸟苷，继续浓缩至利巴韦林即将析出为止，加入纯乙醇，至乙醇终浓度 90％左右，利巴韦林浓度35-45g/L，在85-95℃加热，充分搅拌溶解利巴韦 林，趁热过滤，将上清在0-4℃结晶1-2d，过滤制得利巴韦林结晶；

c.将利巴韦林晶体重新溶解于90％的乙醇，利巴韦林浓度35-45g/L， 85-95℃加热溶解过滤，0-4℃结晶10-12h，即重结晶，经过两次重结晶后， 离心分离、干燥即可得到利巴韦林纯品。

上述利巴韦林的制备方法，最终利巴韦林晶体纯度达到99％以上，提取过 程总收率达到75％以上。

优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(1)的具体步骤包括：

a.斜面活化，37℃培养12-14h，斜面培养基组分(g/L)：蔗糖1，蛋 白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl5，琼脂条25，pH7.0-7.2；