[发明专利]一种利巴韦林的制备方法

权利要求书

1.一种利巴韦林的制备方法，其特征在于：具体方法为：

(1)以基因工程菌BL21/pET-His-pupG为菌种，使用发酵罐培养，获得 细胞；

(2)使用明胶包埋细胞，制成固定化重组表达PNPase的全细胞作为催 化剂，经酶促反应得到利巴韦林转化液；

(3)利巴韦林转化液提取

a.对利巴韦林转化液8000r/min离心5-10min，获得上清液，将上清 液加热至60-80℃，使用1-2％的活性炭脱色20-40min，过滤得滤清液；

b.将滤清液减压蒸发浓缩至1/4-1/3，在0-4℃结晶10-12h，过滤析 出的鸟苷，继续浓缩至利巴韦林即将析出为止，加入纯乙醇，至乙醇终浓度 90％，利巴韦林浓度35-45g/L，在85-95℃加热，充分搅拌溶解利巴韦林， 趁热过滤，将上清在0-4℃结晶1-2d，过滤制得利巴韦林结晶；

c.将利巴韦林晶体重新溶解于90％的乙醇，利巴韦林浓度35-45g/L， 85-95℃加热溶解过滤，0-4℃结晶10-12h，即重结晶，经过两次重结晶后， 离心分离、干燥即可得到利巴韦林纯品。

2.根据权利要求1所述的利巴韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤 (1)的具体步骤包括：

a.斜面活化，37℃培养12-14h，斜面培养基组成(g/L)：蔗糖1，蛋 白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl5，琼脂条25，pH7.0-7.2；

b.无菌条件下吸取无菌水于3-5支活化斜面，使用无菌水将菌体重悬后 接入5L发酵罐中，初始装液量为3L，通气量2-4L/min，搅拌转速200-500 r/min，通过自动流加氨水控制pH在7.0，培养温度35-37℃，培养至OD₆₀₀＝12-14时，离心收集菌体，发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5， KH₂PO₄1，NaCl2，MgSO₄·7H₂O1，葡萄糖2，乳糖15，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的利巴韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤 (2)的具体方法包括：明胶浓度15％，戊二醛浓度0.5％，细胞包埋浓度100 g/L-400g/L，制成固定化重组表达PNPase的全细胞为催化剂，在20mmol/L 的pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液中，底物鸟苷和TCA浓度各100mmol/L，进行酶 促反应，固定化重组表达PNPase的全细胞用量10g/L-40g/L，反应温度 50-60℃，经酶促反应16h-28h生产利巴韦林。

4.根据权利要求3所述的利巴韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤 (2)中磷酸盐缓冲液pH7.6，酶促反应温度55℃，细胞包埋浓度200g/L， 固定化重组表达PNPase的全细胞用量20g/L，反应周期20h。

5.根据权利要求1所述的利巴韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤 (2)所得利巴韦林采用HPLC法进行测定，使用Agilent1260型高效液相色 谱仪，进样量5μL，流动相：4％乙腈，柱温18.5℃，流速1mL/min，检测 波长207nm。

6.根据权利要求1所述的利巴韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤 (3)b中减压蒸发浓缩条件为：真空度-0.06～-0.1Mpa，温度85-95℃。