[发明专利]一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测Vimentin的新方法，尤其是通过外周血检测肾癌患者Vimentin的方法。

背景技术

波形蛋白(Vimentin)是一种重要的中间丝纤维蛋白，主要生物学功能为:维持细胞与细胞器形态、促进细胞粘附及移行、参与有丝分裂及细胞分化、创伤愈合、信号传导、移植免疫及细胞凋亡等。其主要在间叶组织中表达，可作为在组织病理学诊断中鉴别肿瘤细胞分化起源的特异性生物标记物。研究表明,Vimentin高表达与肾癌细胞的分化程度低、侵袭性强和易转移有密切关系，Vimentin可作为肾癌分期、分级及预后判断的指标，为肾癌术后靶向药物或细胞因子辅助治疗提供依据及治疗靶点，因此，正确检测肾癌患者的Vimentin表达至关重要。

目前通常使用的Vimentin检测方法有两种。一种是免疫组织化学方法，通过检测肾癌组织标本中的Vimentin蛋白表达情况判定Vimentin状态。另外一种方法是蛋白免疫印迹法(Western blot)，特异性更高，目前临床应用亦越来越多。这两种检测方法均是以肾癌组织为检测对象，尤其适用于肾癌行手术切除治疗的患者。但对于部分缺乏手术指征或存在手术禁忌症的肾癌患者(如晚期肾癌患者)，由于肿瘤组织无法切除，细针穿刺组织又容易造成肿瘤播散，Vimentin状态评估变得困难。

发明内容

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它存在于肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。

为了克服晚期肾癌患者不适宜组织标本取材，进而无法评估患者Vimentin状态的不足，本发明提供了一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测Vimentin表达情况。

本发明采用的技术方案如下：

一、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC：

1、采集晚期肾癌患者外周血：肘正中静脉5ml；

2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；

3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用精细镊子取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。

二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：

1、脱色：将上述载玻片上带有CTC的滤膜取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀。

2、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；

3、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；

4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；

5、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。

三、检测Vimentin表达情况：

1、薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PBS(PH＝7.4)浸泡3次，每次3分钟；

2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；