[发明专利]一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法

权利要求书

1.一种肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于，检测方法步骤如下：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期肾癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测Vimentin表达情况；

所述的利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期肾癌患者外周血中的CTC，步骤如下：

1)采集晚期肾癌患者外周血：肘正中静脉5ml；

2)外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；

3)利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；

4)过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器(3)，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用精细镊子取下滤膜(7)，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，步骤如下：

1)脱色：将上述载玻片上的滤膜(7)取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀；

2)包裹：浸泡结束后取出滤膜(7)，用吸水纸包裹；

3)固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；

4)浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；

5)薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片；

所述的检测Vimentin表达情况，步骤如下：

1)将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分钟；

2)采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖继续加热至喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；

3)3％H₂O₂去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次2分钟；

4)滴加Vimentin一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次2分钟；

5)滴加通用型IgG抗体，室温或37℃孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；

6)应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟；

7)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；

8)细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定Vimentin表达情况。

2.根据权利要求1所述的肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。

3.根据权利要求2所述的肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台(8)上；滤器上口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。

4.根据权利要求3所述的肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔(10)。