[发明专利]一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于农业和生物技术领域，具体涉及防治马铃薯疮痂病的菌株，以及微生物菌 剂的制备方法及微生物菌剂的使用方法。

背景技术

近年来，随着马铃薯种植面积的不断扩大，马铃薯疮痂病发生和危害程度也逐年加重。 连年种植条件下，土传病菌得已存活、繁殖、侵染、危害。马铃薯疮痂病是土传病害危害 最重的一种病害，在采用多种化学药剂防治的基础上，近年有发病严重的趋势。疮痂病发 生后，病斑虽然仅限于皮层，但病薯不耐贮藏，外观难看，对马铃薯的品质影响很大，造 成商品价值下降，经济损失严重，一般可减产10％～30％，部分地块甚至减产40％以上。 由于其具有随水及其它方式传染的特征，防治不当或不及时将会造成更大的灾难性损失。

马铃薯疮痂病为细菌性病害，病原菌是链霉菌，在适宜土壤中可永久存活。病菌侵入 植株后，地上部分看不到症状，但薯块表面会出现疮痂。土壤干燥、通气性好、中性或碱 性的地块易发病，发病后病菌能在土中长期残存。田间主要侵染薯块，块茎表面先产生褐 色小点，扩大后形成褐色至棕褐色、圆形或不规则形的大斑块。病斑表面细胞大量木栓化， 表现为粗糙的锈色疮痂状。后期病斑或呈裂出状、高出叶表面1～2mm的凸起疮痂，或 呈内延和下陷、深入1～7mm的凹陷疮痂。凹陷病斑多为暗褐或近黑色，病斑处组织似 稻草黄褐色且略显半透明状。总体上，病斑限于皮层而不殃及皮下的薯肉，有别于粉痂病。

土壤自身带菌和种薯带菌传入土壤，继而繁殖。在防治得当的情况下当年当季不会形 成危害；在防治不当的情况下，当年当季就会形成危害。马铃薯收获后，通过病残体及土 壤存活，有的细菌通过不断繁殖存活长达十年难以根除。

细菌在PH值为6-7时是存活繁殖最好的环境，而马铃薯适宜高产的PH值为5.5-7.0。 因为使用化肥追求高产，连年种植条件下土壤碱性增大，有利于细菌繁殖，同时也使得与 之有拮抗关系的有益菌减少。

发明内容

本发明要解决现有枯草芽孢杆菌防治马铃薯疮痂病存在的菌剂以土壤灌溉的形式使 用而带来的不仅用量大且耗费人工的技术问题；而提供了一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯 疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法。

本发明中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12，由呼兰区白奎镇庆平屯马铃薯田 间感病区域的土壤中分离得到，对马铃薯土传病菌具有较强的拮抗作用。保藏在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCCNo.10603。

本发明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12革兰氏染色阳性，杆状，两端钝平，多 数菌体串联成串，呈不规则形状。产芽孢，30℃培养24h芽孢形成率达80％以上，芽孢 端生，椭圆形，不膨大，培养至48h，芽孢全部脱落。在NYDA固体培养基上的菌落呈 乳白色，褶皱，边缘不整齐，菌落中心凸起呈脊状，易挑起。

本发明枯草芽孢杆菌PB12在50℃可以生长，pH5.7可以生长，7％NaCl可以生长， 厌氧条件下不生长。发酵葡萄糖产酸不产气，接触酶反应阳性，淀粉水解呈阳性，VP试 验呈阳性，利用柠檬酸盐反应呈阳性，明胶液化反应呈阳性，石蕊牛奶还原胨化反应呈阳 性，硝酸盐反应呈阳性，甲基红反应呈阳性。

本发明枯草芽孢杆菌PB12可在NYD培养基上生长，最适生长温度为30℃，最适pH 为7.2～7.5，转速150r/min。NYD培养基由牛肉浸膏8g、酵母膏5g、葡萄糖10g、琼脂 15g和蒸馏水1000mL组成。

本发明中枯草芽孢杆菌PB12由呼兰区白奎镇庆平屯马铃薯田间感病区域的土壤中 分离得到。分离方法按以下步骤进行：一、以马铃薯疮痂病菌为靶标，取马铃薯田间感病 区域土壤10克，放于100mL带玻璃珠和无菌水的三角瓶中，震摇20分钟，使土样和水 充分混合，将细胞分散。二、利用梯度稀释法稀释至10³、10⁴、10⁵三个梯度，将该批次 的浓缩液进行梯度稀释涂布于NYDA培养基上，置于32℃培养箱内培养18h，挑选不同 菌落形态的菌株进行标号并分离培养；分离出的单个菌落接入装有NYD培养基(5mL) 的试管中，于32℃，150r/min培养18h。选择拮抗作用强、抑菌谱广的生防菌株进行纯 化、保存。即为本实施方式的枯草芽孢杆菌PB12。