[发明专利]一种拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及纳米高分子材料领域，具体是一种拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的制备方法及应用。

背景技术

“纳米花”属控制合成花状纳米材料，独特的形貌和卓越的性能近年来成为纳米材料领域中最新研究热点，主要应用于催化、电学、生物诊断、信息存储、分析科学等领域。三维花状结构的纳米材料由于独特的形貌和复杂的结构使其具有高比表面积、高活性、高稳定性等优于其他低维纳米材料的性质。目前，在无机纳米花的合成上面有了比较成熟的方法，但是有机-无机杂化纳米花的合成仍在探索之中，有机-无机杂化纳米花可以用于细胞成像、生物传感器、医学方法的改进等。将靶蛋白与无机离子杂化制备纳米花具有极大的挑战性，应用前景十分广阔。目前蛋白纳米花主要是通过固定化、接合、交联、自组装、螯合的方式合成，但由于蛋白质对环境的敏感性、实验结果的低重现性、提纯过程的复杂性的这些问题使蛋白杂化纳米花的合成具有很大难度。

拓朴异构酶能够影响DNA的空间构型动态变化来控制基因的复制、重组、表达。调节DNA的空间构型的拓朴异构酶有两种，分别是拓朴异构酶Ⅰ（TopoⅠ）、拓朴异构酶Ⅱ（TopoⅡ）。拓朴异构酶是明确的抗肿瘤药物作用的靶点，一些抗癌药物正是通过抑制拓朴异构酶的DNA合成功能，从而诱导细胞的凋亡促使癌细胞凋亡。

多穗金粟兰金粟兰属植物多穗金粟兰全草。金粟兰植物多具有抗菌、抗肿瘤、增强免疫、抗病毒等活性。多穗金粟兰在传统医学中用于治疗多种癌症，疗效确切。

中草药成分复杂，低含量的有效成分筛选分离难度大。将靶蛋白制成有机-无机杂化纳米花后能很大程度的提高靶蛋白的稳定性和对有效成分的特异吸附性。使靶蛋白能在一些复杂的干扰条件下仍保持快速筛选与识别目标成分，这将极大地提高中草药中有效成分的筛选效率。由于该纳米材料具有高效、稳定和特异选择性的特点，因而具有较广的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高酶稳定性、有效成分筛选高效性的拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的制备方法，具体制备步骤如下：

（1）用超纯水溶解CuSO₄，配成浓度为115～125mmoL/L的CuSO₄溶液；

（2）配置PBS缓冲液使其pH值为7.4，将20mL的上述CuSO4溶液加到3L的拓朴异构酶Ⅱ-PBS缓冲液，在24～26℃下反应3天，将反应产物用超纯水反复超声5～8次，冲洗4～6次，冷冻干燥得固体粉末，即得拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花（铜-拓朴异构酶杂化纳米）。

一种所述的拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的应用，该拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花用于分离多穗金粟兰中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分的提取，其具体提取步骤如下：

（1）多穗金粟兰粗提液的制备

取多穗金粟兰粗粉18～22g，置于500mL圆底烧瓶，加240～260mL体积分数为95%的乙醇，加热回流提取55～65min，重复提取2～3次，滤过，浓缩，回收乙醇得到浸膏，少量水稀释后，用等体积的石油醚、氯仿依次萃取，用旋转蒸发仪减压回收有机溶剂，得到氯仿部位提取液，备用；

（2）固相萃取柱分离多穗金粟兰氯仿提液中的拓朴异构酶抑制有效成分

将上述得到的拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花（即铜-拓朴异构酶杂化纳米）采用干法装柱填充到固相萃取柱中，并用色谱纯甲醇平衡柱子；取多穗金粟兰氯仿提取液上样，用体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液浓缩、干燥，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构；

（3）微型固相吸头萃取小柱分离多穗金粟兰粗提液中的拓朴异构酶抑制有效成分

将上述得到的拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花填充到Tip吸头柱并固定，配合单道移液器，作为吸头小柱微萃取装置；先用色谱纯甲醇活化萃取材料，再用体积分数为20%甲醇溶液平衡吸头材料；吸入多穗金粟兰粗提液上样，用体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液氮气吹干，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：