[发明专利]突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用，属于基因工程及环境技术领域。本发明利用基因合成定点突变平台合成CIPmt4，经3轮易错PCR，抗性筛选得到含5个氨基酸突变(I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。该突变酶的最适反应温度由野生型的25℃提高到45℃，最适反应pH由原来的5.0提高到6.5，高活性反应pH变宽，稳定性增强，更适于工业化应用。除次甲基蓝外，突变酶CIPmt5对染料氨基黑、甲基橙、刚果红、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝的降解最适pH均向中性、碱性方向偏移，并且对7种染料的降解能力均显著高于野生型酶。

技术领域

本发明涉及一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶，同时还涉及该突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法和应用，属于基因工程及环境技术领域。

背景技术

随着染织业发展，大量的染料以废水的形式排放进入周围环境，严重破坏了生态系统，有毒染料废水处理已成为困扰环境保护工作的难题。染织业中的偶氮染料具有复杂的芳香环结构，对理化因素、热和光稳定，较难被生物降解。目前使用的染料废水处理方法主要包括物理、化学和生物的方法。理化方法成本较高，并且不破坏染料结构，只是把染料从一相转移到另一相，会形成新的污染；生物降解工艺具有将染料降解或者转化成二氧化碳和无机盐的潜能，已经逐渐成为有希望替代现有处理工艺的一种方法，其中酶法降解染料已逐渐引起了人们的重视。

过氧化物酶(EC 1.11.1.7)广泛存在于动物、植物和微生物体内，是一类以铁卟啉为辅基、过氧化氢为电子受体的氧化还原酶，可氧化多种有机和无机分子，在免疫检测、生物传感器、工业废水处理方面有着广泛的应用。过氧化物酶家族中研究最多、应用范围最广的是植物来源的辣根过氧化物(horseradish peroxidase，HRP)。但是，HRP的生产受到地域和气候的限制，产量低、周期长，使其在工业上的应用受到限制。由墨汁鬼伞菌分泌的灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase CIP)一经报道就引起了人们的极大关注，该酶最先由Shinmen分离纯化得到，由343个氨基酸组成，与Arthromyces ramo susperoxidase(ARP)在本质上相同。尽管CIP与HRP的同源性不超过10％～16％，但酶学特性和底物广谱性却十分相似。研究发现，灰盖鬼伞过氧化物酶可以参与清除废水中的酚类物质和苯类物质，并用作清洁剂、生物传感器等，它能在较宽的pH和温度范围内有效降解刚果红、甲基橙等偶氮类染料，在纸浆造纸工业极具应用潜力。同时CIP的生产不受地域和气候限制，是一种有望替代HRP成为有广阔应用前景的工业用酶。

灰盖鬼伞属于中温菌，适宜生长在偏酸性环境中，因此产生的CIP在中温和偏酸性条件下才表现出较高的催化活性，并且CIP对H₂O₂不稳定。但作为工业酶制剂，有关CIP的诸多应用都要求在中性或碱性条件、高温环境中进行，例如造纸工业中纸浆的生物漂白，洗涤行业的去污过程等。由于天然CIP的酶学性质致其无法满足工业化应用要求，其产业化应用受到极大限制。