[发明专利]黄瓜雄性不育基因相关SNP标记及应用

说明书

本发明公开了一种黄瓜雄性不育基因相关SNP的标记方法及应用，它是将“YL‑5”雄性不育系为母本与远缘品种“D37‑1”进行杂交，得到杂种F1，由杂种F1自交得到F2代群体，F2代分离群体中存在雄性可育和雄性不育两种表型，再利用重测序与BSA相结合的方法，筛选与雄性不育相关的SNP位点，开发出雄性不育相关分子标记。本发明的方法具有周期短、成本低、效率高，的特点。同时也为分子育种、系统进化、种质资源鉴定中分子标记提供了一种重要的开发途径。

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及黄瓜雄性不育基因相关SNP的标记及应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L )是我国最重要的蔬菜作物之一，在科技部“十一五”国家科技支撑计划开展的“主要蔬菜作物雄性不育育种关键技术集成与良种产业化”重点项目中，黄瓜被列为重要攻关项目。雄性不育基因在很多作物中都有发现，但是，在国内外的文献报道中，至今极少发现有关黄瓜雄性不育基因的报道，更没有与黄瓜雄性不育基因任何相关标记的开发。

2012年春我们首次在一个高代自交系里发现了黄瓜雄性不育突变体，经验证，该不育性状由细胞核隐性基因控制，雄性不育在其他作物中报道很多，但罕有黄瓜雄性不育的报道。以往定位一个新基因的方法，通常利用已有的RAPD、SCAR、AFLP、SSR 等分子标记开发的引物，在差异性状的植物基因组中，大量的扩增，跑胶，筛选差异的条带，需要耗费大量的人力，物力和时间，也只能是将基因初步定为在一个很宽的区域，不能精细的定位一个基因。

发明内容

本发明采用重测序与集群分离分析相结合的方法，精细的定位了此次黄瓜雄性不育基因，为不育基因的克隆打下良好的基础。本发明具有快速、简便、稳定、可靠、低成本、不受环境条件影响等优点，不仅为黄瓜花粉发育的研究提供理论基础，也在黄瓜杂交育种中具有很大的应用价值。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种黄瓜雄性不育性相关基因SNP的特异性引物，其核苷酸序列如下所示：

引物对1：

正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’

反向引物：5’ TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGCGTA 3’

引物对2：

正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’

反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGTGGC3。

本发明进一步公开了黄瓜雄性不育性相关基因SNP的特异性引物进行标记的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将“YL-5”雄性不育系为母本与远缘品种“D37-1”为父本进行杂交，得到杂种F1，由杂种F1自交得到F2代群体，F2代分离群体中存在雄性可育和雄性不育两种表型；

（2）通过CTAB法提取父本，母本，F2代每个单株基因组DNA，形成4个混池，对这4个混池的DNA进行重测序，对测序得到的原始双端序列进行质量评估并过滤得到清晰读数，将清晰读数与参考基因组序列进行比对，基于比对的结果，使用GATK软件包进行SNP的检测和注释；

（3）根据SNP的检测结果，筛选两个混池间有差异的碱基位点，混池间不一致或为杂合型的SNP位点，并确定SNP在基因组中的位置，以及是否引起基因的非同义突变，从而影响编码的蛋白序列，性状相关侯选区域的选择通过混池的基因型频率差异进行筛选，使用SNP-index关联算法选择候选区域；