[发明专利]一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于贝类病原检测技术领域，具体涉及一种通过巢式聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction,PCR)检测牡蛎疱疹病毒(Ostreidherpesvirus1,OsHV-1)的 方法。

背景技术

自20世纪90年代末以来，OsHV-1引起包括我国在内的全球11个国家和地区海水 养殖双壳贝类的大规模死亡。目前已知受影响的宿主物种包括牡蛎(6种)，扇贝(2种)， 蛤类(2种)和魁蚶在内的11个物种；其中受影响最严重的是我国养殖的栉孔扇贝 (Chlamysfarreri)和欧洲养殖的长牡蛎(Crassostreagigas)。建立准确、灵敏和快速的检 测方法是及早发现病害病原并采取相应防控措施前提和基础。

目前对于OsHV-1的检测，最常用的方法是聚合酶链式反应(PCR)技术；PCR所 采用的引物多是基于病毒基因组C区设计的，其中基于C2和C6位点设计的一对引物， 被OIE推荐为该病毒的PCR检测的通用方法，该方法已被多个国家和地区广泛采用。 然而最新的比较基因组学分析结果表明，C区是牡蛎疱疹病毒基因组中序列变异最大的 几个基因片段之一。同时近年来OsHV-1分子流行病学监测数据和研究结果表明，该病 毒2008年以来发生了较强的株系分化；因基因组C区碱基组成或排列顺序发生变异而 产生的新变异株不断出现，从而导致基于该区核苷酸序列设计的OsHV-1检测引物无法 与目标位点结合；最终导致基于C区建立的多种普通和巢式PCR检测方法，不能准确 检出部分OsHV-1变异株感染的存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法，可以弥 补现有检测技术只能对部分病毒变异株进行检测的不足，使牡蛎疱疹病毒的检测更准确 和灵敏；可用于双壳贝类各时期养殖过程中牡蛎疱疹病毒的跟踪检测。

本发明首先提供一种检测牡蛎疱疹病毒的巢式PCR检测引物，

Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇(SEQIDNO:1)、

Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇(SEQIDNO:2)、

nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇(SEQIDNO:3)、

nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇(SEQIDNO:4)；

本发明另一个方面提供一种牡蛎疱疹病毒的巢式PCR检测方法，即首先从待检测 样品中制备反应模板，并配制巢式PCR反应体系，然后通过巢式PCR反应程序对反应 模板进行扩增，最后根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳是否产生目的条带对检测结果进行判 断，如果显示目的条带则表示该样品的牡蛎疱疹病毒检测结果为阳性；

具体包括如下的步骤：

步骤1)基因组DNA提取：采用普通动物组织的DNA提取方法，从约30mg的贝 类样本外套膜组织中提取DNA；

步骤2)第一轮PCR扩增：以步骤1)中得到的样本DNA2.0μL为模板，采用 Pol-F/Pol-R引物，经PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物。

步骤3)第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物10倍稀释物2.0μL为模板，采 用nPol-F/nPol-R引物，经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物。

步骤4)PCR扩增产物检测：取4.5μL第二轮PCR扩增产物，加入1.5μL的上样 缓冲液(GeneFinder与6×loadingbuffer按1∶9体积混合)混合后，在浓度为1％的琼脂糖 凝胶中，110伏电压下电泳30min；凝胶成像系统观察并拍照，存在约386bp的特异性 条带，则确定所检测的样本被OsHV-1所感染。

其中步骤2)所用PCR反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer 5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL，Mg²⁺(25mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L) 各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水30.6μL补齐到50μL的反应体系。