[发明专利]一种从微量辣椒疫霉菌游动孢子中提取RNA的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用Trizol法从微量辣椒疫霉菌游动孢子中提取RNA的方法，属于分子生物学领域。

背景技术：

卵菌是重要的植物病原菌，常见的卵菌包括霜霉病和疫霉病菌。卵菌可产生孢子囊，加入灭菌水置于4℃后孢子可释放为游动孢子。在土壤中游动孢子对多种植物的根系具有趋性(辣椒、玉米、油菜，茴香等)，因此是一种研究真菌与植物根际互作的良好试验材料。目前，在研究互作机理时，植物根际对真菌菌丝和游动孢子的影响是科学家关注的重要方面：多种根际真菌菌丝均可人工批量培养，因此植物根际对菌丝的生理生化研究相对深入，如番茄，西瓜和茄子的枯萎病菌通过识别寄主的根系分泌物来完成寄主的识别和定植，在这些研究中多采用枯萎病菌菌丝，而对病原菌孢子的研究则相对较少，目前的研究只停留在对孢子萌发率、休止孢萌发率等细胞学水平。而在互作过程中，游动孢子和休止孢的萌发为何会受到植物根系分泌物或化学药剂的抑制，在此过程中游动孢子在生理生化水平受到何种影响，诱发了游动孢子的何种防御途径，这些问题则需要在转录水平进行解析。而在此过程中，多数卵菌的游动孢子难以富集，且在富集过程中游动孢子容易裂解死亡，进而影响了游动孢子RNA的提取是一个关键的制约因素。

因此，迫切需要建立一种可以从微量游动孢子中提取RNA的方法，用于研究植物根系分泌物或者化学药剂对真菌游动孢子在转录水平的影响，为植物根系和微生物互作研究提供技术支持。

本发明提供一种从微量辣椒疫霉菌游动孢子中提取RNA的方法，经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中卵菌游动孢子难以富集、易裂解，量少的不足，而提供一种从微量辣椒疫霉菌游动孢子中提取RNA的方法。

本发明的从微量辣椒疫霉菌游动孢子中提取RNA的方法，其具体步骤如下：

a.均匀加3mL预冷且含RNase抑制剂、1μL/mL的DEPC水于产孢的辣椒疫霉培养皿中，置于4℃冰箱放置10min，使游动游动孢子释放于水中，形成游动孢子悬浮液；将含5000个游动孢子的悬浮液转入15mL离心管中，于4℃，18000g离心5min，弃上清；

b.加入1mLTrizol、1μLβ-巯基乙醇、1μLRNase抑制剂，剧烈斡旋1min，转入1mLEP管中，于20℃超声波处理5min；

c.离心：加入200μL氯仿，剧烈斡旋1min，置于室温15min，于4℃，12000g离心15min；

d.将上层水相转入新的1.5mLEP管中，加入500μL异丙醇，于手中上下翻转5-10次，再加入2μL的糖原，1μLRNase抑制剂，置于-20℃，过夜放置12h；

e.于4℃，12000g直接离心15min；管底形成沉淀；

f.弃上清，加入1mL75％乙醇，剧烈斡旋30s，2次；

g.于室温晾干10分钟；

h.加入10μLDEPC水溶解。

以上操作均于超净工作台中完成，所用市售的移液器、枪头以及用具均按常规方法用0.1％DEPC水进行处理。本方法采用通用的分光光度计检测，当吸光度比值：1.8<A260/280<2.0为合格。

本发明的有益效果在于：

1、有效降低了在游动孢子富集过程中，裂解游动孢子释放的RNase对RNA的降解，从而保证了RNA的质量；

2、由于本方法采用了过夜冷冻沉淀，以及糖原的加入，和以往的RNA易降解、需快速提取有所不同，本方法有效的富集了RNA，而RNase抑制剂的第二次加入也防止了RNA的降解，为从微量辣椒疫霉游动孢子中提取RNA提供了一种有效的方法。

附图说明：

图1显示实时荧光定量PCR的扩增曲线、多组分检测曲线和溶解曲线。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明作进一步的描述。

本发明利用Trizol法从微量辣椒疫霉菌游动孢子中提取RNA的方法，其具体步骤如下：

a.均匀加3mL预冷且含RNase抑制剂、1μL/mL的DEPC水于产孢的辣椒疫霉培养皿中，置于4℃冰箱10min，使游动孢子释放于水中，形成游动孢子悬浮液；将含5000个游动孢子的悬浮液转入15mL离心管中，于4℃，18000g离心5min，弃上清；

b.加入1mLTrizol、1μLβ-巯基乙醇、1μLRNase抑制剂，剧烈斡旋1min，转入1mLEP管中，于20℃超声波处理5min；