[发明专利]定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法

说明书

技术领域

本发明设计一种微塑料健康风险评价方法，更具体来说就是一种基于荧光标记技术定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布规律的方法，即一种基于现代荧光技术分析微塑料这种新兴污染物在哺乳动物体内富集和分布的新型检测方法。

背景技术

众所周知，塑料这种材料在当今生活中的重要作用。各种塑料制品在给人们生活带来各种便利的同时，也带来了各种潜在健康风险，其中最突出就是塑料制品在被丢弃后经过一定的物理、化学、生物等作用，会变成颗粒越来越小的塑料颗粒——微塑料。但是这种塑料颗粒不会被自然环境降解，而是一直存留在环境中，甚至会进入生物体内，带来环境健康风险。在评价微塑料的健康风险过程中，急需准确、灵敏、方便快捷的方法来检测微塑料在生物体内的富集和分布规律，这是准确评估微塑料健康危害的基本前提。

目前的研究多集中在证明微塑料是否能进入生物体内，其方法可总结为：水生动物进行一定量的微塑料暴露，然后采用高倍显微镜或者偏振光检测仪器检测生物体内是否具有微塑料。然而，这些研究主要针对水生生物，对哺乳动物体内微塑料含量缺乏有效的检测方法，且这些方法通常只能定性分析，不能进行准确的定量，也无法得到微塑料在不同组织器官的富集和分布规律。

因此，急需一种简单、灵敏、准确定量分析微塑料在哺乳动物生物体内富集和分布规律的方法。本发明整合材料合成技术和荧光检测技术，可以有效的采用荧光微塑料对模式动物进行暴露实验，准确进行生物体内微塑料含量的检测，为微塑料健康风险评价奠定基础。

发明内容

针对现在普遍缺乏对哺乳动物体内微塑料含量准确定量的方法，本发明提供一种基于荧光技术分析体内微塑料含量的方法，即基于荧光微塑料的制备和荧光检测方法结合的生物学检测方法，通过本发明可以对不同粒径的微塑料在生物体内分布及其富集规律进行准确的定量分析，为后续的微塑料毒性评价提供基础数据。

具体来说，本发明采用了以下技术方案：

一种定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)荧光微塑料颗粒的制备：首先配制10-20mL的三氯甲烷与异丙醇1：1体积比的混合溶剂，然后称取0.1-0.2g交联聚苯乙烯微球和5-10mg的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入上述混合溶剂中，并在超声和氮气保护条件下分散溶解，充分溶解后的混合液体进行干燥，然后用50-70%乙醇洗涤以去除多余荧光染料，接着离心回收荧光微塑料，制备出带绿色荧光的PS微球；

(2)哺乳动物暴露实验：选择上述合成的荧光标记微塑料作为受试样品，选取模式哺乳动物进行灌胃染毒实验，以健康哺乳动物作为空白对照组；

(3)样品采集：荧光微塑料染毒周期结束以后，受试动物解剖，采集组织样品；

(4)冷冻干燥组织样品：使用冷冻干燥仪，分别冷冻干燥空白对照组和染毒组的组织样品至恒重；

(5)湿法消解样品：称取一定量的冻干组织样品，采用湿法消解组织样品；

(6)荧光定量检测微塑料含量：采用空白对照组动物的组织消解液，加入已知含量的荧光微塑料，制备不同浓度梯度的悬浊液，在设定的最大激发波长和最大发射波长下，用荧光光谱仪检测其荧光值，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线，然后检测染毒组组织消解液的荧光值，根据标准曲线确定组织液微塑料浓度，并换算出各组织中微塑料含量。

其中，在步骤（1）中，超声分散条件为在100W超声下处理15-20分钟，干燥条件为真空干燥箱中在0.15Mpa、32℃-35℃下干燥12-16小时，以50-70%乙醇洗涤并随后在6000rpm/min下离心10-20分钟，洗涤和离心重复3-5次，以回收制备出的绿色荧光PS微球。

在步骤(2)中，模式哺乳动物为大鼠或小鼠，染毒实验的染毒周期为一周。

另外，在步骤(3)中，所采集的组织样品为肝脏、肾脏、小肠或其组合。

进一步，在步骤（4）中，冻干条件为在-10大气压和-50℃条件下冷冻干燥组织样品至恒重。

其中，在步骤(5)中，称取一定量的冻干组织样品，采用湿法消解组织样品，具体消解条件为每0.1克组织样品中加入1毫升的65%V/V硝酸，70℃水浴2小时，然后加入与硝酸等体积的30%V/V双氧水，85℃水浴2小时，消解结束后，消解液呈现淡黄透明，定容到10毫升。

在步骤(6)中，设定的最大激发波长为445nm，最大发射波长为550nm。

有益效果