[发明专利]一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种采用一步法进行DNA末端 修复/加dA的方法及应用。

背景技术

基于Illumina平台的下一代测序(next-generationsequencing,NGS)中，需 要测序的DNA必须首先均匀截断为一定长度，然后在其两段添加上测序必须的 接头，完成DNA文库的制备。

超声波打断或能够随机切割双链DNA的酶混合物是目前应用最为广泛的 DNA打断方法。通过这些方法打断形成的DNA，其两段的状态具有异质性， 带有5’-凸出或3’-凸出。对于超声波打断的DNA，其5’和3’末端的磷酸基团或 羟基基团也不一定。为了将这些末端异质性的DNA片段两端均添加上测序必须 的接头，必须对末端进行修复，使其成为满足接头连接的一致形式。

针对DNA末端的异质性特征，目前的修复包括以下几个步骤。

利用T4DNApolymerase或者KlenowFragment的5’-3’DNA聚合酶活性， 在dNTP存在条件下，将5’-凸出末端进行补平。利用T4DNApolymerase或者 KlenowFragment的3’-5’DNA外切核酸酶活性，不需要dNTP，将3’-凸出的末 端切平。这两个活性合并称为DNA平末端化(blunting)。随后利用T4 polynucleotidekinase的正向反应活性，在ATP存在条件下，在DNA的5’-末端 添加磷酸基团。以上过程习惯性称为DNA末端修复。

利用KlenowFragment(exo-)的DNA聚合酶非模板依赖性DNA聚合酶活性， 在DNA的3’-末端以dATP偏爱性方式添加dA，由于缺失了3’-5’DNA外切核 酸酶活性(exo-)，使得添加的3’-末端凸出的dA得以保存。

目前的各种DNA文库制备试剂盒中的DNA末端修复方案都是基于以上原 理。通过寻找一些让不同酶都具有活性的共同反应缓冲液，对其中一些步骤进 行合并，以简化操作步骤，缩短实验时间，并降低在不同反应环境中切换所进 行的纯化操作带来的DNA损失，以提高DNA文库制备效率。

但是，基于这些酶加工过程的DNA末端修复，由于用于DNA3’-末端加A 与3’-5’DNA外切核酸酶活性不能兼容，导致DNA平末端化、磷酸化和加A 必须分开进行。因此，目前都是将DNA末端修复和DNA末端加dA分为两步 进行，中间还得纯化一次DNA，整体需要的时间在1个半小时左右。

发明内容

本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种采用一步法进行DNA末端修复 /加dA的方法及应用，所述DNA末端修复的方法只需40min左右，提高了DNA 制备的效率。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法， 所述方法采用T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和T4多核苷酸激酶的混合酶 系。

本发明利用同样具有dATP偏爱性DNA末端非模板依赖性加A活性的Taq DNApolymerase完成DNA末端的加A；一方面，TaqDNApolymerase仅在高 温72℃才具有活性，而此时T4DNApolymerase，T4polynucleotidekinase早已 热变性失活，另一方面，T4DNApolymerase和T4polynucleotidekinase均可在 较低温度20℃完成活性，此时TaqDNApolymerase几乎没有活性，不会干扰 DNA平末端化过程，因此在合适的反应条件中，以上过程可以在一个反应体系 中完成。

本发明寻找到T4DNApolymerase，T4polynucleotidekinase，TaqDNA polymerase三者同时具备活性的反应条件，即缓冲液条件和反应温度控制，可 以将末端修复和加dA在一步完成，并不是所有的缓冲液调节和反应温度都可 达到本发明超快速一步化DNA末端修复和加dA的效果。