[发明专利]一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法及应用

权利要求书

1.一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法，其特征在于，所述 方法采用T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和T4多核苷酸激酶的混合酶系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T4DNA聚合酶、TaqDNA 聚合酶和T4多核苷酸激酶的体积比为1：(0.1-5)：(1-15)，优选为1：(0.3-3)： (2-10)，进一步优选为1:0.5:5。

3.一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的预混液，其特征在于，所 述预混液包括权利要求1或2所述的混合酶系、dNTPs、ATP、反应缓冲液和去 离子水。

4.根据权利要求3所述的预混液，其特征在于，所述dNTPs中的dATP和 dCTP+dTTP+dGTP的浓度比为(1-20)：2，优选为(5-10)：2，进一步优选为 7：2；

优选地，所述ATP的浓度为0.1-5mM，优选为0.1-3mM，进一步优选为 0.2mM。

5.根据权利要求3或4所述的预混液，其特征在于，所述反应缓冲液包括 Tris-HCl，KCl，MgCl₂和DTT；

优选地，所述Tris-HCl的浓度为5-50mM，优选为10-40mM，进一步优选 为20mM；

优选地，所述KCl的浓度为10-80mM，优选为20-60mM，进一步优选为 30mM；

优选地，所述MgCl₂的浓度为0.5-8mM，优选为1-5mM，进一步优选为 1.2mM；

优选地，所述DTT的浓度为1-15mM，优选为3-10mM，进一步优选为4 mM。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的预混液，其特征在于，所述预混液为 10μL，包含以下组分：

缓冲液：

去离子水加至10μL。

7.一种如权利要求3-6中任一项所述的预混液的使用方法，其特征在于， 所述方法包括如下步骤：

(1)将待修复的DNA打断，取打断的DNA2-10ng；

(2)将步骤(1)中打断的DNA与预混液混匀，15-30℃反应后升温再反 应。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤(2)所述打断DNA 与预混液的体积比为1:5，优选为1:3，进一步优选为1:1；

优选地，步骤(2)所述升温前的温度为16-25℃，优选为20℃；

优选地，步骤(2)所述升温前的反应时间为5-30min，优选为10-25min， 进一步优选为20min；

优选地，步骤(2)所述升温后的温度为60-78℃，优选为65-75℃，进一步 优选为72℃；

优选地，步骤(2)所述升温后的反应时间为5-30min，优选为10-23min， 进一步优选为15min。

9.一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包含如权利要求3-6中任一项所述的预混液。

10.一种如权利要求1或2所述的方法，或如权利要求3-6中任一项所述 的预混液，或如权利要求9所述的试剂盒在DNA文库制备中的应用。