[发明专利]一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法。

背景技术

猪圆环病毒病（PorcineCircoviralDisease，PCVD）是由猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）引起的一系列疾病的总称。我国自从2000年证实猪群中存在PCV2感染以来，各地区已有陆续报道该病的发生，2002年由PCV2感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PWMS）在全国呈暴发流行。据统计分析，近年来我国PCV2感染率呈逐年上升趋势，目前该病的流行范围已经波及全国各地，成为危害我国养猪业的重要免疫抑制性疫病之一。PMWS是最先被报道与PCV2相关的疾病，但随着研究的深入，研究人员发现与PCV2有关的疾病除PMWS外还有猪皮炎与肾炎综合征、呼吸道疾病综合征、仔猪先天性震颤以及繁殖障碍等。PCV2不但在环境中普遍存在，而且对消毒药物耐受力又较强，因此疫苗免疫成为控制PCVD的重要手段。

目前市场上猪圆环病毒疫苗种类繁多，疫苗免疫效果一般用ELISA检测动物抗体和仔猪攻毒试验来检验。用ELISA方法检测抗体虽然时间短，但是由于生产工艺问题，ELISA检测试剂盒不够稳定，各厂家之间的结果经常存在差异，而且只能定性检测，无法做到定量检测，而仔猪攻毒试验存在费时费力，操作复杂，而且PCV2攻毒模型建立困难，容易造成散毒等缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、抗原批间差异小、检验结果准确的猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：

1)筛选猪圆环抗原抗体阴性动物作为实验动物，用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行1--2次免疫，每次1--2头份；

2)最后一次免疫后14-21天，无菌采集实验动物血清，将收集到的血清在56℃下灭活30-min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，得到中和液；

3)用细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1-0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附30-60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；

4)在细胞板中加入维持液并置于37℃的CO₂培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO₂培养箱中培养24h-48h；

5）弃去细胞板中的维持液，细胞采用间接免疫荧光法进行丙酮固定、然后荧光染色、按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗的效价。

所述步骤1）用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行2次免疫时，2次免疫时间间隔为14-21天。

所述实验动物为小鼠、豚鼠、猪或兔。

所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。

所述步骤2)无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离不少于0.5mL血清。

所述维持液为MEM维持液。

所述步骤2）的猪圆环病毒抗原的浓度为200TCID₅₀/0.1mL。

所述步骤2）的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:1024以上。

所述步骤2）每个稀释度的血清与猪圆环病毒抗原等量混合。

所述细胞板为96孔细胞板。

本发明采用以上技术方案，首先用猪圆环病毒灭活疫苗对实验用动物进行1--2次免疫，而后无菌采集动物血清，经灭活后，用维持液对无菌采集的免疫动物血清做倍比稀释，并用含200TCID₅₀/0.1mL的猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，将中和液接种于生长PK-15细胞的96孔细胞板中，置37℃的CO2培养箱中培养后染色观察，计算血清抗体的中和效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。