[发明专利]一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1)筛选猪圆环抗原抗体阴性动物作为实验动物，用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行1-2次免疫，每次1-2头份；

2)最后一次免疫后14-21天，无菌采集实验动物血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，得到中和液；

3)用细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1-0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附40-60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；

4)在细胞板中加入维持液并置于37℃的CO₂培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO₂培养箱中培养24h-48h；

5）弃去细胞板中的维持液，细胞采用间接免疫荧光法进行丙酮固定、然后荧光染色、按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗的效价。

2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤1）用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行2次免疫时，2次免疫时间间隔为14-21天。

3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述实验动物为小鼠、豚鼠、猪或兔。

4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。

5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2)无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离不少于0.5mL血清。

6.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述维持液为MEM维持液。

7.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2）的猪圆环病毒抗原的浓度为200TCID₅₀/0.1mL。

8.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2）的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:1024以上。

9.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2）每个稀释度的血清与猪圆环病毒抗原等量混合。

10.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述细胞板为96孔细胞板。