[发明专利]高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、其编码基因及其制备方法

说明书

本发明公开了一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶及其制备方法和应用，其氨基酸编码序列如SEQ ID NO.2所示，共542个氨基酸，其理论分子量为61.85kDa。本发明提供的高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶(XylRBM26)有β‑D‑木糖苷酶活性和α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶活性，能够在高木糖环境下保持较高的活性(Ki值500mM)，其最适pH为6.5，最适温度为50℃；在45℃条件下耐受60min，仍能保持95％以上活性，能将木二糖、木三糖、木四糖彻底水解成木糖。该酶可做为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品、饲料、能源工业等。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、其编码基因及其制备方法。

背景技术

木聚糖为植物半纤维素的主要组分，木糖是其完全降解的终产物，完成整个水解过程需要木聚糖酶系的协同作用。木聚糖酶主要包括：内切1，4-β-D-木聚糖酶(endo-l，4-β-D-xylanohydrolase，EC 3.2.1.8)，它主要是随机切割木聚糖的主链生成不同长度的木寡糖；β-木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37)，作用于低聚糖和木二糖使其最终降解为木糖；而a-D-葡萄糖醛酸苷酶(a-D-glucatronidase，EC 3.2.1.139)、乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase，EC 3.1.1.72)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a-L-arabinofuranosidase，EC 3.2.1.55)、阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase，EC3.1.1.73)等酶在去除侧链取代基团发挥作用。通过这些酶的协同作用，木聚糖能够有效地被水解(Collins et al.FEMS Microbiol Rev，2005，29:3-23)。

β-木糖苷酶在整个协同水解过程中可以降低木聚糖的水解产物从而可以较大程度的解除产物对木聚糖酶的抑制，是木聚糖水解过程中的限速酶。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可以催化水解以α-1，3、α-1，2或α-1，5键连在木糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚体侧枝。研究表明，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶和木糖苷酶等存在协同作用能促进木聚糖的降解。有些木聚糖主链在侧链没有降解前，其糖苷键无法被木聚糖酶完全水解。另一方面，一些只能降解侧链的辅助酶，需要在木聚糖主链部分水解后才能发挥作用(Dumbrepatil etal.J Microbiol Biotechnol，2012，12:1724-1730)。

木糖是β-木糖苷酶的一种强抑制剂，β-木糖苷酶将低聚木聚糖降解为木糖或协助木聚糖酶将木聚糖降解为木糖的过程中，随时间增加，终产物木糖的产量也增加，当积累到一定量时，会使酶促反应速率降低并抑制反应的继续进行。一般不同来源的β-木糖苷酶的木糖耐受性都是极低的，尤其是真菌仅能耐受2～10mM的木糖(Zanoelo et al.J IndMicrobiol Biotechnol，2004，31：170-176)，因此，高木糖耐受性的β-木糖苷酶在半纤维素降解过程中有巨大潜在应用价值。

L-阿拉伯糖是一种没有热量的甜料，能抑制水解双糖的酶，抑制因摄入蔗糖而导致的血糖升高，因此可以抑制肥胖、预防并治疗与高血糖相关的疾病；此外，L-阿拉伯糖可用于合成核苷类似物等抗病毒药物，治疗白血病、癌症的化疗药物等。L-阿拉伯糖的工业提取方法一般是采用碱提取植物中的半纤维素，然后酸水解，但该方法工艺成本高，环境污染严重。因此，高效、节能、环保的生物转化方法生产L-阿拉伯糖，对我国的生物能源产业和功能糖产业都有非常重大的意义。

中国专利公开号102051350A，公开了一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶和编码该酶的基因。该酶不仅有阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的功能，而且能够在低温的环境下保持较高的活性，但该酶的木糖耐受性较小，其环境适宜能力依旧难以满足现有工业需要。

发明内容