[发明专利]单域抗原结合性分子的纯化方法

说明书

本申请是中国发明专利申请(申请日：2009年10月29日；申请号：200980153069.5 (国际申请号：PCT/US2009/062651)；发明名称：单域抗原结合性分子的纯化方法)的分案申 请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年10月29日提交的U.S.SerialNo.61/109,481的优先权，将其全 部内容通过提述以其整体并入本文。

序列表

本申请含有已经通过EFS-Web提交并通过提述以其整体并入本文的序列表。所述 创建于2009年10月28日的ASCII拷贝名为w223738w.txt，大小为12,853字节。

背景技术

重组蛋白如抗体通常含有多种需要在蛋白产物成为药学上可接受的之前去除的 杂质。这些杂质中的一些可以包括宿主细胞蛋白(HCP)、DNA分子、产物蛋白的变体和/或错 误折叠的形式、和高分子量聚集体(HMWA)。在抗体生产过程中聚集体的形成是个问题，因为 其能够通过在给药时引起补体活化或过敏性反应而对产物安全性产生负面影响。聚集体形 成还可能通过造成产物产率减少、峰变宽和活性损失而妨碍制造工艺。这些杂质在不同的 色谱模式可能具有宽泛的停留模式。去除这些广谱杂质通常是困难的，通常需要多个涉及 不同色谱模式的步骤。

常见蛋白纯化方法是基于要纯化的蛋白质和污染物之间在大小、电荷和溶解性上 的差异来预测的。基于这些参数的方案包括，但不限于，亲和色谱、离子交换色谱、体积排阻 色谱和疏水相互作用色谱。然而，这些色谱方法有时在分离聚集或多聚的抗体类型中存在 技术困难。例如，像离子交换和疏水相互作用色谱等技术可能诱导因洗脱(elusion)过程中 蛋白质浓度的增加或缓冲液浓度和/或pH中所需要的变化而造成的聚集体形成。另外，在多 种情况下，抗体在等电点上显示出的差异太小以至于不能通过离子交换色谱进行它们的分 离(Tarditi,J.Immunol.Methods599:13-20(1992))。体积排阻色谱趋于繁琐且导致对产 物的严重稀释，这在大规模的、以效率为基础的制造工艺中是个阻碍。还可能发生从亲和色 谱柱的配体渗漏，其导致不想要的对洗脱产物的污染(Steindl,J.Immunol.Methods235: 61-69(2000))。

尽管可以在重组蛋白的纯化过程中采用几种不同模式的色谱，但是仍然需要开发 减少使用的色谱步骤数目并且不破坏或不显著降低重组蛋白的生物活性的纯化工艺。

发明内容

本发明部分基于如下发现，即单域抗原结合性(SDAB)分子与蛋白A或其功能性变 体相互作用，例如结合，由此使得在所述SDAB分子的纯化中能够使用基于蛋白A的亲和色 谱。在其他实施方案中，所述SDAB分子能够使用其他色谱技术纯化，如例子(例如，阳离子) 交换色谱。所述SDAB分子可以包含一个或多个单一抗原结合域，其与一种或多种靶蛋白(例 如，肿瘤坏死因子和/或人血清白蛋白)相互作用，例如结合。在某些实施方案中，所述SDAB 分子是包含一个或多个纳米抗体分子的单链多肽，其基本上不含互补性抗体域和/或免疫 球蛋白恒定区。因此，本发明涉及单独地或组合地使用色谱技术如基于蛋白A的亲和色谱和 离子(例如，阳离子)交换色谱纯化或分离包含一个或多个单一结合域(例如，一个或多个纳 米抗体分子)的SDAB分子的工艺和方法。

[注意：纳米抗体^TM是AblynxN.V.的注册商标]

因此，在一个方面，本发明描述了一种从含有SDAB分子和一种或多种污染物的混 合物(在本文也称作“SDAB分子预备物(preparation)”)分离或纯化SDAB分子(例如，一个或 多个纳米抗体分子)的方法或工艺。所述方法或工艺包括：将所述混合物与基于蛋白A的载 体或离子(例如，阳离子)交换(CEX)载体在允许所述SDAB分子结合或吸附至所述载体的条 件下接触；去除一种或多种污染物，例如，通过在所述SDAB分子保持结合于所述载体的条件 下清洗结合的载体(例如，用至少一种蛋白A或CEX清洗缓冲液清洗结合的载体)；和从所述 载体选择性洗脱所述SDAB分子，例如，通过用至少一种蛋白A或CEX洗脱缓冲液洗脱吸附的 SDAB分子。

在一个实施方案中，所述分离或纯化SDAB分子的方法包括将所述SDAB分子和一种 或多种污染物的混合物与阳离子交换载体接触。