[发明专利]一种菊粉内切酶的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域，具体地说，涉及一种经基因工程技术优化后的菊粉 内切酶基因经重组大肠杆菌表达后高效制备菊粉内切酶的方法及其应用。

背景技术

菊粉是由β-2,1-糖苷键连接D-呋喃果糖分子组成的线性直链多糖，末端常带有一个葡萄糖， 聚合度DP通常为2～60之间，通常存在于菊苣，菊芋及雪莲果等植物的根状块茎中。菊粉酶 是能够水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶类，学名β-2,1-D果聚糖水解酶(EC3.2.1)， 又称β-果聚糖酶，2,1-D-果聚糖水解酶。微生物菊粉酶可以催化植物中的菊糖水解为果糖或低 聚果糖。根据其对底物的作用方式不同，菊粉酶分为两类。一类是外切果聚糖水解酶(EC 3.2.1.8)，又称外切菊粉酶，外切菊粉酶从菊糖或低聚果糖分子的非还原末端依次水解β-D果 糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖分子的果聚糖，最终产物为果糖和葡萄糖。另一类是内 切果聚糖水解酶(EC3.2.1.7)，又称内切菊粉酶。内切菊粉酶从菊糖分子内部随机切断β-2,1- 呋喃果糖苷键，得到GF₂、GF₃、GF₄、F₂、F₃、F₄、F₅等低聚果糖和短链果聚糖。内切菊粉酶 在工业领域用于生产低聚果糖有很大的潜力。

应用内切菊粉酶这一催化特性，内切菊粉酶能以菊粉为底物，催化菊粉水解成低聚果糖。 低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，具有重要的健康、药用开发价值。制备适 合工业化生产的内切菊粉酶是生产低聚果糖技术的关键。

菊粉内切酶主要分布在微生物中，目前研究较多的产菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和细 菌。其中丝状真菌有17个属40余种，酵母菌有10个属20余种，细菌有12个属10余种。研 究较多的产菊粉酶丝状真菌主要包括Aspergillusniger、Penicilliumsp、Rhizopusdelemar、 Fusariumoxysporum、Talaromycesflavusvarflavus和Chrysosporiumpannorum等，其菊粉酶多 为胞外酶；酵母主要有Kluyveromycesfragilis、Kluyveromycesmarxianus、Debaryomyces cantarellii和Saccharomycesfragilis等，其菊粉酶多为胞内酶或与细胞壁相结合；细菌主要有 Bacillussubtilis、Athrobactersp.、Pseudomonassp.和Xanthomonassp.等，其菊粉酶以胞外酶为 主。研究表明，大部分微生物分泌的菊粉酶主要为外切酶，或内外切混合酶。鉴于直接从野生 菌中提取内切菊粉酶存在工艺复杂，提取率低且较难将内外切菊粉酶分开及成本昂贵等问题， 寻找廉价、高效的外源基因表达方法是目前内切菊粉酶的研究热点。

无花果曲霉(AspergillusficuumATCC16882)具有编码内切菊粉酶的基因endo-inu2。本 发明以AspergillusficuumATCC16882的endo-inu2基因为来源序列，通过基因工程技术对基因 序列进行优化，选用大肠杆菌作为宿主，构建此具有内切菊粉酶活性的重组大肠杆菌。大肠杆 菌遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作，是表达外源蛋白的首选体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效制备菊粉内切酶的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种菊粉内切酶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

步骤一，构建大肠杆菌工程菌：将经过基因工程技术优化后的编码菊粉内切酶的基因序 列pelB-NSinu2，插入到大肠杆菌pET28a载体上，构建出pET28a-pelB-NSinu2质粒，导入大 肠杆菌EscherichiacoliBL21中，构建出高效分泌表达菊粉内切酶的重组大肠杆菌E.coliBL21 pET28a-pelB-NSinu2；

步骤二，利用步骤一获得的大肠杆菌工程菌进行发酵，实现菊粉内切酶的分泌表达；

步骤三，提取发酵上清液，对该上清液进行纯化得到菊粉内切酶液。

进一步地，步骤一所述的构建大肠杆菌工程菌的具体步骤如下：