[发明专利]一种菊粉内切酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

步骤一，构建大肠杆菌工程菌：将经过基因工程技术优化后的编码菊粉内 切酶的基因序列pelB-NSinu2，克隆到pET-28a(+)载体，构建出 pET28a-pelB-NSinu2质粒，导入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中，构 建出分泌表达菊粉内切酶的重组大肠杆菌E.coliBL21pET28a-pelB-NSinu2；

步骤二，利用步骤一获得的大肠杆菌工程菌进行发酵，实现菊粉内切酶的 分泌表达；

步骤三，提取发酵上清液，对该上清液进行纯化得到菊粉内切酶液。

2.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，步骤 一所述的构建大肠杆菌工程菌的具体步骤如下：

1)提取无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882总DNA；

2)用PCR方法克隆无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882的endo-inu2 基因；

3)将上述克隆出来的endo-inu2基因片段优化为基因片段inu2；

4)对基因片段inu2和来自pET-20b(+)载体的pelB基因运用同源重组方法 设计引物，用PCR方法从inu2基因序列和pET-20b(+)载体上分别克隆缺少内源 信号肽序列的NSinu2基因及pelB信号肽基因序列；

5)将PCR出来的带有同源臂序列的pelB片段及NSinu2序列片段与线性化 克隆载体pET-28a(+)混合后，反应30min进行转化，完成定向克隆，构建出将 pelB与NSinu2融合表达的重组质粒pET28a-pelB-NSinu2；

6)然后将重组载体pET28a(+)-pelB-NSinu2转入大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌重组菌EscherichiacoliBL21 pET28a-pelB-NSinu2。

3.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，步骤 二所述发酵的具体步骤如下：

1)挑取重组菌单菌落于LB培养基中培养过夜，以含有空载体的细菌样品 和重组菌做对照；

2)次日，将实验组与对照组按体积比1％接种量接种至新鲜50mL发酵培 养基中，37℃，200r/min振荡培养；

3)待菌液生长至OD₆₀₀到0.7左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度为 0.5mmol/L，30℃诱导10小时。

4.根据权利要求3所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，所述 的发酵培养基包含如下组分：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，K₂HPO₄72mmol/L， MgSO₄10mmol/L，硫胺素0.034g/L，硫酸卡那霉素0.03g/L，微量元素2mL/L， 该微量元素成分为CaCl₂·6H₂O0.74g/L，ZnSO₄·7H₂O0.18g/L，MnSO₄·H2O20 g/L，Na₂·EDTA20.1g/L，CuSO₄0.1g/L，CoCl₂0.104g/L,FeSO₄·7H₂O2g/L。

5.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，所述 的步骤三提取发酵上清液的方法为4℃下，转速8000r/min，离心菌液15min。

6.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，步骤 三所述的纯化采用HisSepharoseHP凝胶柱进行亲和层析。