[发明专利]一种利用质谱数据分析蛋白交联位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的蛋白质交联位点分析，涉及食物蛋白的交联加工改性。

背景技术

蛋白质交联指的是通过一定的化学试剂或催化剂，在蛋白质内部多肽链之间或蛋 白质之间形成共价键，从而起到改善蛋白质功能性质的目的，交联过程中，共价键的形成可 能伴随着消去部分基团，也可能伴随着附加部分基团。目前蛋白质交联广泛应用于植物蛋 白，肉制品以及烘焙食品等的加工中，它可以改变蛋白之的结构和性质，从而改善蛋白质的 品质。例如，转谷氨酰氨酶可以催化花生过敏原蛋白Arah2发生交联反应，降低其致敏性， 改善其消化性。

交联后蛋白性质的变化与其交联位点有着密切的关系，比如戊二醛与大豆蛋白交 联后，大豆蛋白疏水性显著增加，溶解性降低，这些性质的改进都涉及到蛋白质的交联位 点。因交联位点的不同对蛋白的高级结构影响，对蛋白的功能改变都不同，因此交联位点的 鉴定对蛋白性质的变化具有重要意义。目前尚无比较简单合适的蛋白质交联位点鉴定方 法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用质谱数据分析蛋白交联位点的方法，寻找和发现 蛋白质交联反应发生的位点。本发明的方法通过分析质谱数据，将理论交联肽段质荷比与 质谱数据进行比对，搜寻蛋白质的交联位点。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明所述的一种利用质谱数据分析蛋白交联位点的方法，具体步骤如下：

(1)理论酶切肽段的分析与筛选。

选取合适的酶，以能将各交联位点分开为宜。根据所选择的酶的特异性酶切位点， 列出酶切后可能出现的所有片段，筛选出含有潜在交联位点的酶切片段，并计算每个肽段 的分子量。

(2)理论交联片段分子量的预测。

将步骤(1)中含有潜在交联位点的片段进行组合，即获得理论交联片段库。计算理 论交联片段库中各交联片段的分子量(理论交联片段的分子量为交联片段的分子量之和减 去交联反应时消去基团的分子量，或者理论交联片段的分子量为交联片段的分子量之和加 上交联反应时附加基团的分子量)，再根据可能的电荷量计算获得的各交联片段可能的质 荷比。

(3)交联蛋白的酶切及质谱分析。

采用步骤(1)选择的蛋白酶对交联复合物进行酶切，并按照常规方法对酶切片段 进行质谱分析。

(4)数据比对与分析。

用相应软件查看质谱数据，得到各峰对应的质荷比，与步骤(2)计算的理论交联片 段质荷比进行匹配，匹配成功则理论的交联片段即为实际交联片段，理论预测的交联位点 为真，由此获知蛋白质交联的位点。

本发明利用质谱分析的数据来实现蛋白质的交联位点分析。质谱法是一种同时具 备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法，能够准确地测定生物大分子的分 子量，获得的数据可以用于蛋白质的交联位点分析。

本发明的技术效果在于不需要复杂的计算公式或者程序，只需要简单的计算及比 对就能找出蛋白质间的交联位点。

附图说明

图1为本发明质谱分析数据及比对结果。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施中，选用转谷氨酰胺酶催化交联的花生过敏原蛋白Arah2.02为研究对象， 在SDS-PAGE电泳胶图中切出交联的蛋白条带，选用胰蛋白酶进行酶切，可以将交联位点K分 开，再经液质联用分析，得到的质谱数据利用MZmine软件(可以查看每个峰对应的质荷比及 所带的电荷量)打开查看，进行数据比对获知交联位点。具体实施步骤如下：

(1)胰蛋白酶理论酶切肽段的分析与筛选。

首先，选择胰蛋白酶酶切，它能将可能的参与交联位点K逐一分开。蛋白交联复合 物选用胰蛋白酶进行酶切，花生过敏原蛋白Arah2.02中共有个3赖氨酸，酶切将这三个可 能的交联位点分开。

根据Arah2.02的氨基酸序列以及胰蛋白酶的酶切位点，可得到胰蛋白酶作用后 Arah2.02蛋白的理论分子片段，如表1所示。由于转谷氨酰胺酶催化交联反应的催化位点 为赖氨酸(K)与谷氨酰胺(Q)，因此能够参与交联反应的片段必定是含有K或Q的片段，经过 筛选，含有Q的片段共有17个，含有K的片段共有4个，这些可能的交联片段及其分子量如表2 所示。