[发明专利]用于检测CYP2C19基因分型的引物对、荧光探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，通过设计特异性引物对和荧光探针来检测CYP2C19基因的CYP2C19*2(681G/A)和CYP2C19*3(636G/A)等位基因分型。本发明采用不对称PCR与荧光探针熔解曲线分析技术相结合，通过特定温度的熔解峰来判断不同基因型，可在单管PCR反应中实现与CYP2C19*2、CYP2C19*3相关的6种基因分型检测，无需后续处理，最大限度避免了反应产物污染的可能性，且操作简单、耗时短、特异性好、准确率高，结果易判读。

技术领域

本发明涉及等位基因分型领域，特别涉及一种用于检测CYP2C19基因CYP2C19*2、CYP2C19*3基因分型的引物对、荧光探针、试剂盒及方法。

背景技术

随着医学科技的发展，新药层出不穷，然而用药问题也越来越多，临床上使用的许多药物如抑制剂-奥美拉唑、抗抑郁药-氟西汀、抗癫痫药-苯妥英钠、抗肿瘤药-环磷酰胺等，其用药及药物代谢存在个体化差异，例如同一种药同一剂量用在不同病人身上，疗效却可能完全不同，有的痊愈，有的却可能发生严重的药物不良反应甚至致死，据世界卫生组织统计，全世界每年因药物不良反应致死1900万人左右。

研究表明药物代谢的个体化差异主要源于遗传因素。体内药物代谢主要通过细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)同功酶完成。CYP2C19(S-美芬妥英羟化酶)是CYP450的主要组成之一，代谢一系列临床上使用的药物如奥美拉唑、氯吡格雷、氟西汀、依替唑仑、苯巴比妥、苯妥英钠、环磷酰胺等。

CYP2C19具有很多SNP位点，最常见的是CYP2C19*2(681G>A)和CYP2C19*3(636G>A)，CYP2C19*2会导致转录蛋白的剪切突变失活，而CYP2C19*3能构成一个终止子，破坏转录蛋白的活性。因而，CYP2C19等位基因突变可能导致S-美芬妥英羟化酶的活性下降，代谢底物的能力减弱，从而导致药物代谢的表型差异。有研究报告指出，CYP2C19对药物代谢的能力随着等位基因的不同组合而呈现出规律性，CYP2C19*1/*1野生纯合子代表强代谢型(EM)，CYP2C19*1/*2或CYP2C19*1/*3突变杂合子代表中间代谢型(IM)，CYP2C19*2/*2或CYP2C19*3/*3突变纯合子以及CYP2C19*2/*3突变杂合子代表弱代谢型(PM)。

通过对CYP2C19基因型与奥美拉唑临床疗效的研究发现，奥美拉唑与阿莫西林等抗生素联用治疗幽门螺旋杆菌感染性消化道溃疡，PM和IM患者愈合率明显高于EM患者；而对氯吡格雷的研究显示，氯吡格雷口服后必须在体内经CYP2C19代谢为有效产物才能发挥抗血小板凝集作用，因此，IM患者需通过增加药量达到抗血小板凝集效果，而PM患者却需加用或改用其它抗凝血药物。

因此，研究CYP2C19基因分型对于预测药物给药条件、毒副作用的强弱和药物疗效是极为重要的。通过CYP2C19基因分型检测，区分不同药物代谢能力的基因型个体，检测其CYP2C19酶对相关药物代谢速率的快慢，可以指导临床合理选择药物类型、调整药物剂量，并制定个体化用药方案。

目前，对于CYP2C19基因分型的检测的方法有很多种，常规的方法包括：(1)直接测序法，通过抽取人外周静脉血，提取基因组DNA，扩增后进行DNA直接测序，从而判断基因型；该方法能够直接显示已知突变位点的位置和类型，然而，其操作步骤繁琐，试剂和仪器昂贵，检测周期长且成本较高。(2)酶切序列分析，基于突变的发生而形成的限制性内切酶酶切位点的消失或增加的原理进行分析；该方法虽然简便、经济，然而，难以实现高通量平行分析，且无法分辨杂合子。(3)芯片法，应用已知的核苷酸序列作为探针与标记的靶核苷酸序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析；该方法可进行高通量分析，然而，其技术成本高、检测步骤复杂、且分析泛围较窄。上述方法难以满足临床检验对CYP2C19基因分型检测的需求。

针对上述问题，本发明设计了一种简单、快速、价格低廉、特异性高的CYP2C19检测产品和方法，以用于临床检测。