[发明专利]一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程育种技术领域，尤其涉及一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法，及利用这一方法在获得抗逆转基因小麦上的应用。

背景技术

小麦是主要的粮食作物之一，其总产量仅在玉米之下。到目前为止，我国培育小麦新品种主要是通过常规杂交育种的方法。但这种方法周期较长、可选择范围比较窄，而且其预见性比较差、性状改良的效率也较低，因而延缓了小麦育种的发展进程。

与常规育种相比，分子育种缩短了育种的年限，为不同物种之间的遗传交流提供了可能，弥补了常规育种的不足，得到了广泛的利用和关注。随着植物遗传转化技术的日益完善，利用转基因技术有目的、精确的改良植物遗传性状创制转基因新材料新品系已成为目前小麦育种的新方向。同时随着小麦基因组测序工作的完成，大量基因将被克隆和进行功能研究。转基因小麦研发和小麦功能基因组学研究需要获得大量转基因植株，迫切需要提高小麦转化效率，扩大转化规模，建立高效、安全、规模化转基因技术体系，推进转基因小麦产业化和小麦功能基因组学研究进程(叶兴国等2014)。

普通小麦(TriticumaestivumL.)为六倍体植物基因组庞大，在主要农作物中，小麦属于遗传转化比较困难的作物，转化效率较低，重复性较差，转化规模较小，优良转基因材料较少，基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物(叶兴国等2014)。目前，应用于小麦的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法，有些实验室也采用花粉管通道、离子介导、激光微束穿刺、PEG、花粉介导和农杆菌浸花等方法(叶兴国等2014)。其中基因枪转化法是小麦遗传转化中采用的最主要的转化方法，绝大多数的转化事件是由基因枪法转化得到的。但基因枪转化法依赖于组织培养再生途径，组培程序复杂，材料的无菌转接操作繁琐，转化过程对操作人员的操作技术水平要求较严；许多优良基因型再生困难；且基因枪法成本较高；转化效率低而不稳，转化效率一般在0～1％(叶兴国等2011,2014)；转化的外源基因拷贝数较多，易引起基因表达沉默；经过组织培养易产生无性系变异；而且再生植株有嵌合体现象；转基因后代多为杂合状态，纯合时间较长，在自交纯合过程中外源基因易丢失。农杆菌转化法也需要通过组织培养途径，成本较低且在双子叶植物上已基本成熟，在单子叶植物小麦上随着不断地改进近年也有所进展，但在实际应用中仍存在小麦愈伤组织对农杆菌不敏感、侵染后愈伤组织极易褐化死亡，往往导致转化失败(叶兴国等2011；张洁等2013)。花粉管通道法是利用植物自然授粉过程中花粉管伸入到子房中形成的花粉管通道，外源基因借助此通道进入胚囊，整合入受体植物基因组中完成转基因过程。花粉管通道法不需要通过组织培养途径，也是借助自然授粉受精过程进行基因转化，成本低、不受植物种类限制，但是重复性和稳定性较差，现有报道其转化率为0.135％(张立等2013)，转化效率较低也不稳定。而其他的一些转化方法如显微操作、离子束介导法在小麦上目前应用也较为困难，效率低下，在小麦未见有成功的报道。超声波花粉介导法是利用超声波多次瞬时处理花粉导入外源基因，再通过授粉获得转基因植株，在油菜、玉米、芥菜等作物上已有转化成功的报道，但在小麦转基因中未见报道。

小麦的遗传转化难度大、效率低，已成为目前制约小麦转基因研究发展的重要限制因素。因此，研究探索一种不依赖组织培养途径、操作简单、成本低、高效稳定的小麦遗传转化方法，对促进小麦转基因研究具有重要的意义。

电击法是将细胞置于高电场、低电容的环境中，利用高圧直流电给予细胞瞬时脉冲(微秒-毫秒)，使细胞膜瞬间被击穿，产生微小孔洞，细胞膜出现通透性，引起一些分子、离子的运动与流动压迫细胞膜，使其通透性增加，外源大分子或DNA的片段由这些孔洞进入细胞中(张有明等2004)。在适当的电场强度下，电击后细胞膜上形成的孔洞是可逆的(张小娟等2011)，当外加电场消失后，被击穿的细胞膜的脂质和蛋白质分子在维持极短时间后，可以重新排列恢复到原来的结构，细胞仍保持活力，外源遗传物质随着细胞的生长分化整合进受体细胞基因组。