[发明专利]一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法及其应用

权利要求书

1.一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法，其特征在于，所述小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法以小麦成熟花粉细胞为转化受体，通过对电击液、萌发液电击条件的筛选和优化，优化电击转化体系；利用电击转化法对与干旱高盐和低温等抗逆相关的转录因子基因DREB4A和W17进行转化，以获得转基因植株；

所述小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法具体包括：

从菌液中分别提取含DREB4A和W17基因的质粒；

小麦花粉最适电击液的优化；

电击后FDA染色和观察、统计；

电击后花粉萌发液的优化处理；

授粉及后处理；

基因组DNA的提取；

PCR检测转基因植株。

2.如权利要求1所述的小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法，其特征在于，所述从菌液中提取DREB4A和W17基因的质粒具体包括：

摇菌，提供-20℃保存的带有DREB4A和W17基因的大肠杆菌，在100mL的三角瓶中将其按1：10加入到LB液体培养基中，LB液体培养基的配方：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L，高压灭菌，再加入Amp100μg/mL，37℃、200r/min过夜培养，待整个培养基浑浊后即可；

提取质粒具体包括：

柱平衡：在吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，静置5min，12000r/min、1min离心，倒掉收集管里的废液；

收集菌体：将菌液加入到2mL的离心管中，用12000r/min、1min进行离心；每个离心管中收集大概5mL菌液的的菌体；

菌液重悬：加入250μL的重悬液，涡旋或者用移液枪吸打均匀；

碱裂解：加入250μL的裂解液，温和地上下翻转6-8次，充分裂解；

中和：加入350μL的中和液，温和地翻转6-8次；

柱结合：4℃静置10min，用12000r/min、10min进行离心；再将上清液加入到用平衡液BL处理过的吸附柱CP3中，静置5min,12000r/min、1min离心，弃去收集管里的废液；

去蛋白：在吸附柱CP3中加入500μL的溶液PD，静置5min,12000r/min、1min离心，弃去收集管里的废液；

漂洗并晾干：用600μL的漂洗液清洗过吸附柱CP3，重复2次，每次静置5min,12000r/min、1min离心，最后空离心2min；在通风橱中晾10-20min；

洗脱：加入用65℃预热的60μL的ddH₂O，置5min,12000r/min、1min离心，重复2次；

将提取好的质粒放于-20℃备用。

3.如权利要求1所述的小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法，其特征在于，所述小麦花粉最适电击液的优化具体包括：

收集花粉，选择中间稍有开花的小麦穗子；剪去小穗部分的1/3颖壳，大概3-10min就会看到金黄色的成熟花粉，用50mL的离心管收集。

以PGMBuffer缓冲液作为对照，PGMBuffer缓冲液所包括的组成成分及浓度分别为：100μg/mLH₃BO₃+300μg/mLCa(NO₃)₂+100μg/mLKNO₃+200μg/mLMgSO₄+1.7μg/mLMnSO₄+27％的蔗糖；对其中的有机成分设置不同的浓度和配比进行改良优化，具体的实验操作为：在装有花粉的离心管中，分别加入6mL的对照和不同处理的电击缓冲液清洗花粉，使花粉和缓冲液混合均匀；将用电击缓冲液清洗过的花粉分装入1.5mL或2.0mL的离心管中，12000r/min，离心1min，弃上清；分别加入1mL的不同处理的电击缓冲液，振荡，混合均匀，12000r/min，离心1min，弃上清；分别加入300μL的不同处理电击缓冲液，用移液枪吸打从而混匀，便得到花粉悬浮液；

然后取200μL移入到2mm的电击杯中，再用电穿孔仪进行电击操作，电击参数为组合为：电压为6kv/cm、电容为25μF、脉冲时间为80μs。