[发明专利]一种产过氧化氢酶的发酵工艺

说明书

本发明提供了一种产过氧化氢酶的发酵工艺，属于生物工程领域。以一株粘质沙雷氏菌保藏编号为（CCTCC M 2015732）为出发菌株，仅以大豆粉、红糖和废糖蜜为培养基成分经液体摇瓶发酵可得到高产量的过氧化氢酶，酶活最高高达30420 U/ml。本发明过氧化氢酶制剂制备简单、酶活性高，造价低廉，该酶制剂在纺织、造纸和过氧化氢污水处理等领域有良好的应用前景。

技术领域

本发明提供一株粘质沙雷氏菌为出发菌株发酵生产过氧化氢酶。属于生物工程领域。

背景技术

过氧化氢是一种强氧化剂，广泛应用与工业、食品和医疗领域的漂白和消毒，但是其残留对于严重影响生产工艺和身体健康。过氧化氢酶可以特异性的分解过氧化氢为无毒的水和氧气，是一种高效环保的过氧化氢去除途径。过氧化氢酶广泛存在于动植物和好氧微生物中，最初过氧化氢酶是从猪牛等动物肝脏中提取纯化的，但该方法受限于原料有限、成本高和工艺复杂，相比而言微生物发酵生产过氧化氢酶则有产量大、活性高、酶学性质丰富、成本低廉等诸多优点。目前国外已有相关微生物发酵过氧化氢酶商品，国内有一些文献及专利报道过氧化氢酶产酶菌株，多数菌株产酶能力在每毫升发酵液几百至几千个酶活力单位，仅江南大学陈坚教授和江南大学专利CN 101805709 B报道菌株酶产量达到2万个酶活左右。且过氧化氢酶产量的提高往往依靠过氧化氢、乙醇等的诱导，从而提高发酵工艺的复杂性和生产成本。本发明人提供了一种简单廉价的过氧化氢酶生产工艺，仅以红糖、大豆粉和废糖蜜为营养成分，通过液体发酵得到过氧化氢酶酶液，该酶液过氧化氢酶活力高，基于以上发现提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种产过氧化氢酶的发酵工艺。以一株粘质沙雷氏菌为出发菌株，通过液体摇瓶发酵生产过氧化氢酶，所产过氧化氢酶制剂活性高，制备简单，生产成本低廉，适于纺织、造纸等生产工艺中残留过氧化氢的去除和过氧化氢污水的处理。

本发明的技术方案：

1、应用菌株Kat-1发酵生产过氧化氢酶。工艺如下：

（1）种子液制备：

种子培养基为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏2g/L，NaCl1g/L，pH为7.0。120℃高压灭菌30min。

种子液制备方法：挑取一环菌株的纯培养于50ml种子培养基中，180r/min培养12h即为种子液。

（2）发酵产酶：

产酶培养基制备：大豆粉10~40 g/L，红糖20~50g/L，废糖蜜5~10g/L，无需调pH，120℃高压灭菌30min。其中，大豆粉制备以市售大豆为原料经粉碎机充分粉碎后无需过筛，直接称取所需量配制发酵培养基。

发酵条件：种子液以2% 的接种量转接至含50 ml产酶培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 ~220 r/min培养32~60 h。

（3）过氧化氢酶的制备：发酵液直接冰浴超声破碎直至澄清，超声功率设为400W，超速离心后上清即为过氧化氢酶酶液。

（4）过氧化氢酶活性测性方法：发酵液超声破碎直至澄清，用pH 7.0的PBS缓冲液稀释适当倍数后备用。过氧化氢酶酶活测定方法为3.9 ml反应液（50mM PBS pH 7.0,20 mMH₂O₂) 迅速加入0.1 ml酶液中, 在240 nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H₂O₂的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗1微摩尔H₂O₂ 所用的酶量为1U。

采用的菌株为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） KAT-1，该菌种已于2015年12月9日保存在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015732。