[发明专利]杨梅EST‑SSR分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及杨梅品种4个EST-SSR分子标记技术及其应用。

背景技术

杨梅(Morella rubra)是我国南方特色水果，其果实色泽鲜艳、风味独特，且具有丰富的营养价值，深受消费者喜爱。

分子标记在种质资源多样性研究和分子辅助育种中有着广泛的应用。其中简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)广泛存在于真核生物的基因组中，数量众多，重复性高，是最常用的分子标记之一。SSR可从表达序列标签(Express sequence tag，EST)库或转录组测序数据中挖掘，称之为EST-SSR。与基因组SSR相比，EST-SSR开发相对较易，但其多态性相对较低。筛选高多态性的EST-SSR分子标记对于遗传研究与育种实践均具有重要的价值。

杨梅具有丰富的种质资源，但遗传多样性研究和育种工作受到分子标记不足的限制。近年来，Terakawa等(2006)、张水明等(2009)、谢让金等(2011)、谢小波等(2011)、焦云等(2012)、张绍阳等(2012)以及贾慧敏等(2014)先后开发了一些杨梅SSR或EST-SSR分子标记，为杨梅种质资源研究奠定了良好的基础。但是现有的杨梅EST-SSR分子标记数量还不足以满足种质资源遗传多样性系统分析和遗传图谱构建的需要，更多的具高多态性的EST-SSR标记有待开发。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供4个新的杨梅EST-SSR标记。为了解决技术问题，增加杨梅分子标记的数量应用到今后的杨梅资源多样性分析和品种鉴别等工作中。本发明提供了4个杨梅EST-SSR分子标记，所述杨梅EST-SSR标记分别是四组引物对，其序列依次如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示。

本发明提供的4个杨梅分子标记，其特征如表1所示。

表1 杨梅EST-SSR标记特征(SEQ ID NO:1-8)

本发明的4个杨梅EST-SSR标记是通过以下方法得到的：

(1)利用先前研究获得的杨梅EST序列和MISA软件设计引物，引物设计的原则为：PCR产物长度100-350bp；GC含量40％-70％，最适为50％；退火温度50-65℃；引物长度18-22bp；避免出现引物二聚体。在设计好的正向引物的5’端统一加18个bp的尾巴(M13-TGTAAAACGACGGCCAGT)，另合成加了FAM和HEX两种不同荧光基团标识的M13尾巴引物，引物委托上海生工生物工程有限公司合成；

(2)用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取杨梅品种基因组DNA；

(3)采用SSR分子标记方法进行杨梅分子标记的筛选：以‘荸荠’杨梅的基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μl反应体系中分别加入10×Ex Taq Buffer(含Mg²⁺)，1.6μl的2.5mM dNTP，5units/μl Ex Taq DNA polymerase 0.1μl，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通用荧光引物1pmol，10ng/μlDNA模板1μl，ddH2O补充体系至20μl。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性5min,，然后94℃(30s)/60℃(30s)/72℃(30s)循环20次，之后94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(30s)循环12次，最后72℃延伸15min。产物检测：在含有0.5％μg/μl EB的3％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；

(4)将初步筛选的有扩增产物的引物在另外23个杨梅品种上进行扩增，于ABI遗传分析仪上进行分析，并使用PowerMarker V3.25,Tree32和GenALE×6.501读取数据并分析结果。

本发明的另一个目的是提供所述的4个杨梅EST-SSR分子标记在杨梅种质资源遗传多样性分析以及品种鉴别中的应用。