[发明专利]膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化

说明书

说明

尽管在表达、纯化和结晶策略方面有进步技术，真核生物跨膜受体的结构和详细的生物化学研究仍然受到阻碍。主要的困难是缺乏产生足够数量的所需受体的能力及其固有的不稳定性。

通过定向进化提高大肠杆菌中GPCR的功能性表达水平的方法是本领域中已知的(Sarkar等(2008),PNAS 105:14808-14813；Dodevski&Plückthun(2011),J Mol Biol 408:599-615)。使用该方法已经分离出几种GPCR的高表达变体。然而，由于大肠杆菌不能进行翻译后修饰，缺乏真核生物膜蛋白的分泌质量控制和易位机制，以及在膜组成上不同，因此真核生物的跨膜受体在大肠杆菌中的进化限于在原核系统中固有表达高于成功进化所需的阈值的受体，因此对于真核生物的加工或膜组成没有严格的要求。

因此，需要建立快速、有效和稳定的方法以增加跨膜受体在真核宿主中的功能性表达。原则上，理想的真核宿主将是用于生产进化了的高表达变体的细胞。然而，这些哺乳动物或昆虫细胞不容易使用文库转化，这对于任何类型的定向进化方法是必需的。对于涉及文库的其它过程，使用“较低级的”真核生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常见的。然而，酵母细胞包含细胞壁，其通过限制所给予的配体到达位于质膜中的表达受体来限制功能性分析。对于可溶性蛋白质，该问题的常见解决方案是使用诸如酵母展示之类的方法，其将感兴趣的蛋白表达为存在于细胞壁外面的融合蛋白。然而，该方法不适用于选择不溶性跨膜受体的功能性高表达变体，其必须位于质膜中，并因此位于细胞壁之下，并且不能表达为附着于细胞壁的融合蛋白。

本发明针对的问题是提供新颖有效的方法来促进和加快跨膜受体的研究和药物设计，特别是通过鉴别跨膜蛋白变体，在包含细胞壁的真核细胞中产生优化的功能性表达。这个问题由独立权利要求的主题解决。

术语和定义

在本说明书的上下文中，术语“碱性pH”以其在化学领域中已知的含义使用；它指对水溶液的碱度的度量。pH大于7表示碱性(alkaline)或碱性(basic)溶液，pH小于7表示酸性溶液。

在本说明书的上下文中，术语“还原剂”以其在化学和生物化学领域中已知的含义使用；它指在氧化还原反应中向另一种化学物质提供电子的元素或化合物。在这个过程中，还原剂被氧化。

在本说明书的上下文中，术语“荧光细胞分选或荧光激活的细胞分选(FACS)”以其在细胞生物学领域中已知的含义使用；它们指用于细胞分选的方法，其中细胞悬浮于流体中并通过检测装置。根据通过的细胞的特定荧光信号的强度，每个通过的细胞可以被引导进入不同的隔室中。

在本说明书的上下文中，术语“随机诱变”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用；它指其中将DNA突变随机引入以产生突变基因和蛋白的方法。然后可以将许多这些突变基因编译到文库中。随机诱变方法的非限制性实例为易错PCR、UV辐射和化学诱变剂。

在本说明书的上下文中，术语“文库”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用；它指核酸片段的集合。一种特定类型的文库是通过随机诱变产生的随机的突变体文库。另一种实例为设计的(或合成的)文库，其包含专门工程化的DNA片段。

在本说明书的上下文中，术语“表达水平”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用；它分别指DNA片段及其衍生mRNA的转录水平和/或翻译水平。在某些实施方案中，如果突变基因的表达高于对照基因或野生型基因，则表达水平被认定为是高的。在某些实施方案中，突变基因的表达比对照或野生型基因的表达至少高两倍被认定为高的。

根据本发明的第一方面，提供了一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法，其中根据其表达水平选择序列。所述方法包括以下步骤：

a)提供多个包含细胞壁的真核细胞，特别是多个酵母细胞，其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员。所述核酸序列成员为在所述细胞中可操作的启动子序列的控制下表达的所述细胞的转基因，其在所述多个包含细胞壁的真核细胞中作为靶膜蛋白。

b)在透化步骤中，透化所述多个包含细胞壁的真核细胞的细胞壁，产生多个活的透化的细胞。