[发明专利]膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化

权利要求书

1.一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法，其包括以下步骤：

a)提供多个包含细胞壁的真核细胞，其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员，并且所述核酸序列成员被表达为在所述多个真核细胞中的靶膜蛋白，

b)在透化步骤中，透化所述多个真核细胞的所述细胞壁，产生多个透化的细胞，

c)在标记步骤中，使所述多个透化的细胞与能够结合到所述靶膜蛋白的配体接触，其中所述配体包括可检测标记，产生多个标记的细胞，

d)在洗涤步骤中，洗涤所述多个标记的细胞，

e)在选择步骤中，选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数，产生选择的细胞，和

f)在分离步骤中，从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

i.在所述选择步骤e)后，在扩增步骤中扩增所述选择的活细胞，产生扩增的选择的活细胞，并且所述扩增的选择的活细胞经受所述步骤b)至e)，

ii.所述步骤i.进行至少1、2、3、4、5、6或7次，最终跟随所述分离步骤f)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中：

i.将在所述分离步骤f)中获得的表达的核酸引入多个包含细胞壁的真核细胞并在其中表达，

ii.所述多个包含细胞壁的真核细胞经受根据权利要求1的所述步骤b)至f)，和

iii.步骤i.和ii.进行至少1、2、3、4、5、6或7次。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过将突变引入所述扩增序列的方法扩增在所述分离步骤f)中获得的所述表达的核酸，产生核酸序列的第二文库，和

i.将所述核酸序列的第二文库转移至所述多个包含细胞壁的真核细胞，和

ii.将所述多个包含细胞壁的真核细胞递送至根据权利要求1至3所述的方法。

5.根据前述权利要求的任一项所述的方法，其中通过以将突变引入到扩增序列的方法扩增编码所述靶膜蛋白的核酸序列获得所述表达的核酸序列的文库。

6.根据前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述靶膜蛋白为G-蛋白偶联受体。

7.根据前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述透化步骤包括将所述多个真核细胞暴露于包含锂离子、还原剂和/或螯合剂的碱性pH缓冲液。

8.根据前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述可检测标记为荧光染料，并且所述选择步骤通过荧光细胞分选完成。

9.根据前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述多个真核细胞为多个酵母细胞。

10.一种用于选择具有高水平表达功能性膜蛋白的能力的适应的酵母细胞的方法，其包括以下步骤：

a.提供多个酵母细胞，其中所述酵母细胞中的每个包含表达的核酸序列的文库的核酸序列成员，并且所述核酸序列成员被表达为所述多个酵母细胞中的靶膜蛋白，

b.在透化步骤中，透化所述多个酵母细胞的细胞壁，产生多个透化的细胞，

c.在标记步骤中，使所述多个透化的细胞与能够结合到所述靶膜蛋白的配体接触，其中所述配体包括可检测标记，产生多个标记的细胞，

d.在洗涤步骤中，洗涤所述多个标记的细胞，

e.在选择步骤中，选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数，产生选择的细胞，

f.在扩增步骤中，扩增所述选择的细胞，产生扩增的选择的细胞，

g.将所述扩增的选择的活细胞递送至步骤b.至f.至少1、2、3、4、5、6或7次，

h.将所述扩增的选择的细胞递送至步骤b.至e.，和

i.选择所述选择的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞的可检测标记的函数，从所述扩增的选择的细胞产生所述具有高水平表达功能性膜蛋白的能力的适应的酵母细胞。