[发明专利]涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法

说明书

提供了方法，其包括适合于检测酶比如溶酶体贮积酶的活性的添加剂化合物，其中所述添加剂是油酸的盐。包括油酸的盐出人意料地改善了酶活性和再现性。

相关申请的交叉引用

本申请依赖于2014年9月2日提交的美国专利申请号14/474,524并要求其优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本说明书涉及用于检测酶活性的分析试剂。提供了溶酶体酶活性的检测，其可以被用于检测一种或多种溶酶体贮积紊乱的筛选测定。

背景技术

溶酶体贮积紊乱是特征在于体内缺乏特定酶的一组遗传性紊乱，其导致身体不能分解代谢物质。作为实例，法布里病是在每40,000人中有1人发病的溶酶体贮积紊乱。其由酶α-半乳糖苷酶的缺乏引起，这导致身体不能分解被称为球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)的特定脂肪物质。第二个实例是高歇病，一种由不能分解脂肪物质或脂质——被称为葡糖苷酰鞘氨醇类(也被称为葡糖脑苷脂类)——引起的溶酶体贮积紊乱。患有高歇病的个体不能制造葡糖脑苷脂酶——一种分解这些脂肪物质需要的酶。这些脂肪物质然后在肝细胞、脾细胞和骨髓细胞中累积。第三个实例是蓬珀病，一种由酶酸性α-葡糖苷酶——其在分解被称为糖原的某些糖类中是需要的——的缺乏引起的溶酶体贮积紊乱。当酶酸性α-葡糖苷酶缺失时，糖原在体内的各个组织和器官中累积。

在极大程度上，溶酶体贮积紊乱是儿童紊乱，但是在成年人中也会展现一些。在他们的大多数中，患者在出生时是正常的并且在随后的一些时间开始患有进行性神经恶化。临床表型取决于生化缺陷的类型和严重性。这些溶酶体紊乱中的一些，比如蓬珀病和克腊比病，主要在婴儿期展现。在开发在临床症状的开始之前检测这些紊乱使得治疗性干预可以发起的方法中存在着持续的努力。

大多数目前提供的用于溶酶体贮积紊乱(LSD)的筛选测试基于由Zhang等(Methods Mol Biol.2010；603:339–350)描述的质谱法和材料。该方法，对于六种LSD(蓬珀病、克腊比病、尼-皮二氏病AB、法布里病、高歇病和MPS-1)，使用六种不同的条件在六个不同的器皿中进行六种酶活性测定。已经描述了用于相同紊乱的多重测定(Scott等，JPediatr.2013年8月；163(2):498-503；Spazil等，Clin Chem.2013年3月；59(3):502-11)。多重方法需要较少的实验室劳动和试剂，但是产生与非多重方法类似质量的测定结果通常是更困难的，在该非多重方法中测定条件需要代表支持目标酶的足够活性同时抑制任何混淆过程的折衷(compromise)。各种酶活性增强剂和抑制剂被添加至多重缓冲液以支持优化条件，其使得目标酶中的每一种可测量地作用于其特异性人工底物。

油酸已经被鉴定为GALC酶的增强剂，GALC酶的低活性与克腊比病相关联(Zhang等，同上；Zhang等，Clin Chem.2008；54(10):1725-1728；Li等，Clin Chem.2004；50(10):1785-1796)。该酸已经被加入到缓冲液中用于克腊比病筛选。但是，油酸在水性缓冲液中溶解是非常困难的，并且在测定缓冲液中得到的不同浓度已经导致测定结果具有差的再现性。由于该原因，用于克腊比病筛选的大多数出版的方案省略了油酸，因为再现性问题超过来自增强的酶活性的任何潜在性能优势。

因此，对于改善用于检测溶酶体紊乱的方法和组合物存在持续的需求。

发明内容

提供下面的发明内容以促进对所提供方法特有的创新特征中的一些的理解，并且发明内容不意欲是充分描述。方法的各个方面的充分理解可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为整体来获得。

提供了使用检测系统比如质谱法检测酶反应的改善的组合物和方法。这些组合物和方法提供了与目标酶的改善的反应性，从而改善了测定效率、再现性和准确性。