[发明专利]具有修饰的轻链特异性的肉毒杆菌神经毒素及其生产方法

权利要求书

1.用于检测对非神经元SNARE蛋白具有特异性的蛋白酶的报告构建体，其包括：

第一报告子和第二报告子；以及

插在第一报告子和第二报告子之间的非神经元SNARE蛋白或其可切割片段，

其中所述非神经元SNARE蛋白或其可切割片段的大小设定为调节第一报告子和第二报告子之间的能量转移。

2.根据权利要求1所述的报告构建体，其中所述第一报告子和所述第二报告子是FRET对。

3.根据权利要求1或2所述的报告构建体，其中所述非神经元SNARE蛋白选自由SNAP-23和SNAP-29构成的组。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的报告构建体，其中所述可切割片段包括选自由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3构成的组的肽。

5.一种对非神经元SNARE蛋白具有底物特异性的蛋白酶，其包含具有非天然外部位点识别序列的突变的肉毒杆菌毒素轻链，其中所述非天然外部位点识别序列包括肽序列，所述肽序列具有相对于对应于天然肉毒杆菌毒素外部位点序列的肽序列的突变，并且其中所述突变被选择为提供在所述突变的肉毒杆菌毒素轻链与非神经元SNARE蛋白之间的增强的结合，而不是与神经元SNARE蛋白之间的结合，所述神经元SNARE蛋白充当具有相应的天然肉毒杆菌毒素外部序列的天然肉毒杆菌毒素轻链的底物。

6.根据权利要求5所述的蛋白酶，其中所述突变的肉毒杆菌毒素轻链衍生自肉毒杆菌毒素序列，所述肉毒杆菌毒素序列对应于由BoNT/A,BoNT/B,BoNT/C,BoNT/D,BoNT/E,BoNT/F,and BoNT/G构成的组中的至少一个的轻链序列。

7.根据权利要求5所述的蛋白酶，其中所述非天然外部位点识别序列包括对应于由SEQ ID NO.4的Asn136，Ser143，Glu148，Val304，Thr176，His227，Lys337，Leu256，Val258和Lys356构成的组中的一个或多个的位点的一个或多个突变。

8.根据权利要求6或7所述的蛋白酶，其中Asn136的突变选自由Ala，Arg，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的蛋白酶，其中所述Ser143的突变选自由Asp和Glu构成的组。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的蛋白酶，其中Glu148的突变选自由Lys和Arg构成的组。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的蛋白酶，其中所述Val304的突变选自由Asp和Glu构成的组。

12.根据权利要求6-11中任一项所述的蛋白酶，其中Thr176的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr和Val构成的组。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的蛋白酶，其中His 227的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

14.根据权利要求6至13中任一项所述的蛋白酶，其中Lys337的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

15.根据权利要求6至14中任一项所述的蛋白酶，其中所述Leu256的突变选自由Asp，Ala和Gly构成的组。

16.根据权利要求6至15中任一项所述的蛋白酶，其中Val258的突变选自由Asp，Ala和Gly构成的组。

17.根据权利要求6至16中任一项所述的蛋白酶，其中Lys356的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。