[发明专利]抵抗乳糖杀伤的突变体微生物

说明书

本发明涉及产生抵抗乳糖杀伤现象的突变微生物的方法以及涉及能够通过所述方法获得的微生物。这样的工程化微生物可用于生产特殊产品，例如但不限于特殊的碳水化合物、糖脂和半乳糖基化化合物。

技术领域

本发明涉及产生抵抗乳糖杀伤现象的突变微生物的方法以及涉及能够通过所述方法获得的微生物。这样的工程化微生物可用于生产特殊产品(specialty product)，例如但不限于特殊糖类、糖脂和半乳糖基化化合物。

背景技术

乳糖杀伤(lactose killing)是公知且深入研究的原理，其在乳糖与另一种碳源的存在下阻碍许多生物体的生长。然而，该现象背后的确切机制是未知的，尽管诱导该现象所需的特征相当清楚。当将乳糖添加到在另一种碳源(例如但不限于甘油或蔗糖)上生长的微生物培养物中时，发生乳糖杀伤。当乳糖转运基因为可诱导的或组成型表达(33，39，75)时，也发生乳糖杀伤。最初对于在恒化器条件下用IPTG和乳糖调节乳糖通透酶之表达的大肠杆菌(E.coli)观察到乳糖杀伤(28)。后来对于苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)也观察到乳糖杀伤(55，70，77)。这种现象的潜在原因之一归因于细胞的乳糖转运蛋白活性的所谓“成本”，这种“成本”导致生长减少或抑制，并且还与细胞外乳糖浓度有关(34)，其在工业过程中大多保持高水平以获得足够高的产物滴度和收率。然而，现有技术表明，只要在这些条件下存在乳糖转运，就应该会发生乳糖杀伤。为了解决乳糖杀伤的问题，已经提出了缺失乳糖通透酶或严重损害乳糖摄取(34)。例如，Lodi等(55)缺失(敲除)了乳酸克鲁维酵母中的乳糖通透酶，发现乳糖杀伤不再发生。他们的实验过程中的自发突变进一步表明所选择的乳糖杀伤阴性菌株在其乳糖摄取方面严重受损。然而，为了有效地合成特殊产品或生物产品，乳糖摄取是必需的。因此，缺失乳糖通透酶或严重损害乳糖通透酶活性明显不是解决方案，因为产生这样的生物产品需要1)有效的乳糖摄取和2)不导致“乳糖杀伤表型”的表达盒。先前已使用用于生产基于乳糖的生物产品的乳糖通透酶，但没有解决“乳糖杀伤表型”。在过去，这个问题通过严重减少乳糖摄取(因此产生很少甚至不产生基于乳糖的特殊产品)或者通过将生长阶段与生产阶段分开以优先获得足够的生物量来解决。在该生长阶段之后，在第二阶段中添加乳糖以产生特殊产品。在该第二阶段中，不发生或强烈减少生长(59)。

因此，目前的共识是，为了避免乳糖杀伤，必须消除或严重损害乳糖摄取，因为正常的乳糖摄取将总是导致乳糖杀伤。相比之下，本发明公开了一种筛选方法以找到允许有效摄取乳糖而不经历乳糖杀伤的乳糖通透酶表达盒！

乳糖是许多生物产品，更特别是特殊糖类(14)、糖脂和半乳糖基化化合物(例如半乳糖基脂、半乳糖神经酰胺和半乳糖基化糖苷配基)的结构单元。在许多情况下，半乳糖部分用于药物的器官靶向(28)。然而，由于上述“乳糖杀伤”现象，将乳糖作为基质与其他基质组合使用不像所认为的那样明显。通常，需要多阶段生产系统、非生长耦合细胞系统(non-growing coupled cell system)以避免乳糖杀伤(32，48)。

许多特殊糖类的基本结构骨架由乳糖或半乳糖单元组成。更具体地，人乳寡糖和引申的母乳寡糖(一大类糖类和寡糖)由半乳糖和乳糖单元构成(15)。这些糖类用糖部分进一步修饰，例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸、2-酮-3-脱氧-D-甘油半乳糖壬酮糖酸……)(21)，L-岩藻糖等。然后这些化合物的合成需要活化的糖类，例如UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-唾液酸、GDP-岩藻糖……，这些非常昂贵且难以合成分子并且由于其生物合成所需的能量而最好由活的生长细胞产生。

人/母乳的寡糖组分具有抗炎和益生元效果和/或在治疗学中用作营养品、抗炎剂、益生元(prebiotic)或药物(15，24，68)。然而，仍然需要有效生产后面的高价值化合物的方法。