[发明专利]3型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-3)的变体、组合物及方法

说明书

本申请涉及金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP‑3)突变蛋白、变体及衍生物，编码其的核酸，以及其制备和使用方法；特别是具有特定氨基酸取代以引入N‑连接的糖基化位点的TIMP‑3的突变蛋白。

相关申请的交叉引用及以引用方式并入

本申请要求2014年8月27日提交的62/042,574的优先权益，其在此通过引入并入。

以引用方式全部并入的是与此同时提交并鉴定如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：名为“49907_SeqListing.txt”，154,208个字节，于2015年8月10日创建的ASCII文本文件。

发明领域

本发明通常涉及金属蛋白酶抑制剂。具体而言，本发明涉及金属蛋白酶组织抑制剂3(“TIMP-3”)及其新型有用变体、突变蛋白和衍生物。

发明背景

结缔组织和关节软骨通过胞外基质合成和降解的相反作用而维持动态平衡。基质降解主要通过金属蛋白酶的酶促作用引起，所述金属蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)和具有血小板反应蛋白基序的解离素-金属蛋白酶(ADAMTS)。尽管这些酶在许多天然过程(包括发育、形态发生、骨骼重建、伤口愈合及血管生成)中很重要，但认为这些酶导致其水平升高的调节异常在结缔组织的降解性疾病(包括类风湿性关节炎和骨关节炎)以及癌症和心血管疾患中起有害作用。

金属蛋白酶的内源性抑制剂包括血浆α2-巨球蛋白和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)，其中有四种已知在人类基因组中编码。TIMP-3抑制所有主要软骨降解性金属蛋白酶，且多条证据表明其保护软骨。将该蛋白质添加至软骨-外植体防止细胞因子诱导的降解，并且关节内注射在大鼠内侧半月板撕裂骨关节炎模型中减少软骨损伤。

MMP的调节异常也发生在充血性心力衰竭中，并且被认为其在多种促炎性过程中起作用。然而，开发TIMP-3作为MMP活性的治疗性抑制剂已因重组蛋白产生和重组形式的TIMP-3的短半衰期方面的挑战而受阻。具体而言，在大鼠中静脉内施用后，TIMP-3的血清半衰期少于60分钟，并且此短停留时间不利地影响在疾病部位维持治疗上有用的浓度的能力。因此，本领域需要展现出有利产生、纯化及药物代谢动力学/药效动力学特性的TIMP-3形式。

发明概述

本发明提供具有有利特性的TIMP-3多肽，所述有利特性例如增强的药物代谢动力学或药效动力学特性(诸如半衰期)、与天然TIMP-3相比提高的表达水平、减少的对非靶标(例如清除受体)的亲和力，和/或对于产生而言减少的对肝素的依赖性。

在一些实施方案中，本发明提供TIMP-3多肽，其融合至一个或多个半衰期延长部分，或经一个或多个半衰期延长部分化学修饰。例如，在一些方面，本发明提供融合蛋白，其包含在TIMP-3的N末端或C末端处融合至经分离抗体的Fc结构域的TIMP-3(或其片段)。Fc结构域可经由Fc部分的N末端或C末端融合至TIMP-3(或其片段)。Fc结构域可为单体型或异二聚体型。本发明也涵盖TIMP-3多肽(或其片段)，其融合至人类血清白蛋白或全抗体(在重链或轻链的N末端或C末端处)。在一些方面，对TIMP-3(或其片段)的用以延长半衰期的化学修饰包括缀合至聚乙二醇(PEG)。

在某些实施方案中，TIMP-3蛋白在天然序列中携带突变，导致半衰期提高；此类TIMP-3突变在本文中被描述为例如“TIMP-3突变蛋白”。在各个方面，TIMP-3蛋白在氨基酸序列上与SEQ ID NO：2中所列出的TIMP-3的成熟区域具有至少90％同一性，其中突变蛋白具有引入至少一个N-连接的糖基化位点的至少一种突变。在另一个实施方案中，TIMP-3突变蛋白具有两个、三个或四个新N-连接的糖基化位点；在另一个实施方案中，所引入的N-连接的糖基化位点的数量为五个、六个、七个、八个、九个、十个、十个、十一个或十二个。在各突变蛋白中，还考虑了一个或多个新N-连接的糖基化位点的添加基本上不削弱天然分子的金属蛋白酶抑制活性。