[发明专利]用于细胞分离的微流体方法和盒

说明书

本发明公开一种根据展示以及优选地分泌所关注蛋白质的水平从异源表达细胞的群体中选择细胞的方法，其包括：(a)将所述细胞与磁珠接触，其中所述磁珠涂覆所述细胞的亲和基团；(b)将所述磁珠与所述细胞混合，从而捕获展示/分泌所关注蛋白质的细胞；(c)实施至少一次洗涤步骤，从而除去未捕获的细胞；以及(d)回收结合有磁珠的细胞。

技术领域

本发明涉及根据所关注蛋白质的表达(优选为展示，更优选为分泌)水平使用磁珠从异源表达细胞的群体中选择细胞的方法。此外，本发明还涉及基于所关注蛋白质的表达(优选为展示，更优选为分泌)水平来进行细胞选择的微流体基(优选为一次性)无菌盒(cartridge)，以及用于处理微流体反应室内的磁珠的方法。

背景技术

构建用于高效生产治疗性蛋白质的哺乳动物细胞系已经通过构建更高效的DNA载体和改造细胞系而得到极大的改善(Girod et al.,2007,Galbete et al.,2009,Ley etal.,2013；LeFourn et al.,2014)。然而，人工筛选细胞系是耗时且劳动密集的，其通常仍在实施以识别具有最佳性质的那些，例如具有最高生产率的那些。因此，本领域需要设计从大量稳定转染的细胞群体中筛选顶级生产型细胞系(由此是生产最高水平的转基因的细胞系)的自动化过程。具体而言，需要研发用于快速识别选择和/或分选CHO和其他重组细胞的方法，其中所述CHO和其他重组细胞表达(优选为展示，更优选为分泌)高水平的例如治疗性蛋白质。

在一些学术试验室中具有一些公开文献，其证明使用磁珠/颗粒(例如使用人工操作的管和磁体)分选细胞的可行性。大部分所述方法是缓慢且笨重的，并且具有有限的生产量和功效。此外，人工过程难以适用于GMP(良好的操作规范)或GLP(良好的试验室规范)设备，因此它们通常不能用于生物技术或医药企业中。本发明提出了磁珠在微流体背景中的用途，从而基于给定转基因表达产物的不同表达水平优选达到完全自动化的哺乳动物细胞分离。

尽管Miltenyi出售的MACS装置允许使用磁珠并结合磁性材料柱(在强的永久磁体下操作)从哺乳动物细胞系的培养物中除去死细胞，但是MACS不允许选择性分选磁珠，并且其不允许分选高生产型和低生产型细胞以便优选地识别并选择高生产型细胞。已经公开了依赖于使用抗体标记高生产型细胞的备选方法和仪器。高生产型细胞的快速分离可以涉及使用荧光照相机，其中所述荧光照相机对在软琼脂上生长的细胞集落成像，并与高荧光集落的自动拣选结合。其实例为用于干细胞拣选的TAP的CellCelector^TM(Caronet al.,2009)。备选地，Genetix的ClonePix^TM依赖于在半固体培养基中由分泌的蛋白质形成的免疫沉淀物，类似地，其与照相机和细胞拣选臂偶联。在这些方法中，细胞并非以游离悬浮液的形式生长，而是以簇集物模式生长，并且在克隆过程的早期，特别是在可以建立稳定表达之前拣选。所涉及的设备具有相对低的生产量，因为其不能分析100,000个和更多的转染的细胞，而且通常需要发现繁殖力最强的克隆。此外，所述方法相对较慢，需要实施数天。本发明的基于微流体的方法被设计用于缓解和/或解决现有技术的缺点。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及细胞分选方法，其中所述细胞展示所关注的蛋白质，在某些实施方案中，所述细胞优选地以高水平并且可任选地由复合的克隆群体产生所关注的转基因，例如治疗性蛋白质。

在某些实施方案中，本发明可以使用磁珠在易于使用的微流体系统中以相对短的时间(例如少于36或24小时)识别高生产型细胞系。在其他的实施方案中，使用单次使用(一次性)的盒在持续无菌的环境中分选活细胞(例如高生产型细胞)，如达到GMP相容性细胞分选所需。

本发明还涉及使用磁珠根据所关注蛋白质的表达水平从异源表达的细胞群体中选择细胞的方法。

本发明还涉及识别以及优选地选择在其表面上展示所关注蛋白质的细胞的方法，该方法包括：

(a)提供包含所述细胞的样品；