[发明专利]丙二烯氧化物合酶用于精液保存和辅助生殖的用途

说明书

技术领域

本发明涉及丙二烯氧化物合酶在辅助生殖技术的通用领域的用途。特别是，本发明涉及改善精液(和精子)的稳定性，该精液(和精子)用于辅助受精过程(包括人工授精、体外受精、精子分离)且用于体外操作卵母细胞以改善其生存力和可育性。本发明涉及源自人、牛、马、猪、家禽和其它动物的配子。

背景技术

丙二烯氧化物合酶(AOS)为细胞色素p450酶家族成员(CYP74A；EC 4.2.1.92)，其首先分离自银胶菊橡胶植物灰白银胶菊(Parthenium argentatum)(GenBank CAA55025.2)。AOS也已知为银胶菊橡胶颗粒蛋白(RPP)，其已从银胶菊橡胶植物纯化并克隆(US 5,633,433和US 6,132,711)。

AOS为在生物系统中对脂质过氧化物具有特异性的抗氧化酶。如US 6,132,711所报告，AOS快速将游离或酯化的脂肪酸过氧化物或氢过氧化物转化为其对应的环氧化物，然后环氧化物又转化为酮醇。该酶的脂质过氧化物和氢过氧化物底物据称对生物有机体有毒且可通过链增长反应产生另外的过氧化物，以及引起蛋白质和DNA的氧化损伤。在AOS的存在下，这些化合物被快速转化为环氧化物且链反应被破坏。

相比脂质过氧化物，AOS作用产生的酮醇物质为相对生物惰性的，因此US 6,132,711推测AOS的抗氧化作用可在多种应用中有用。这些应用包括保存植物种子、治疗严重失血的创伤患者、在一些疾病的治疗中促进细胞凋亡，包括在烟草植物中对除草剂的抗性、增加用于人工授精或体外受精的精子的寿命，和增加生物有机体的平均和最大寿命。然而，在US 6,132,711中这些用途完全是推测的，没有实验支持。

许多药物，无论是单一化合物还是多组分物质，无论是来源于天然生物源还是合成制备，都已知显示抗氧化剂行为。一些为广谱抗氧化剂，即它们在一系列生物体系中都显示抗氧化作用，而其它的为选择性的且在特定的一组生物参数中具有抗氧化作用。

此外，抗氧化剂可分类为‘自杀’种类(意思是一个抗氧化剂分子在中和一个活性氧化性物质分子时被消耗)或可分类为酶类，其中酶的单一分子可中和许多氧化性分子。

AOS已显示在治疗严重缺血性损伤和局部缺血-再灌注损伤中具有益处(US 7,157,082)。缺血性损伤通过创伤事件(如中风或心脏病发作)引起，其导致血液供给缺乏，引起组织的氧短缺。局部缺血–再灌注是指当在局部缺血或缺氧一段时间后血液供给返回至组织引起的组织损伤。

精液(以及精子和卵子)的稳定性广泛被认为是在动物人工授精和辅助生殖技术阶段非常显著的约束条件。精液不稳定性增加了成本、低效性和逻辑复杂性。对新鲜精液和冷冻精液都是这种情况，且除了牛繁殖情况之外还包括多种物种。冷冻精子在冷冻和解冻步骤中都具有失去生存力的问题，且新鲜精液受到其非常有限的保存期限(～3天)极大的约束。工业上已通过一系列手段处理稳定性问题以改善效率。例如，在稀释组合物和加工中进行了渐进式的改进以改善存活率。尽管这样，仍然广泛认为精液稳定性是主要的问题且存在持续的需求以寻找改善精液性能的方式。此外，更先进的精液处理技术，如涉及基于精子为X或Y(雌性或雄性)的精子分选的技术，由于所使用的方法而对精子生存力提供了另外的挑战。这些本质上通常为氧化性的，其是由于在加工过程中对细胞造成的热、压力、光、化学或生物化学损害所产生。

本申请人目前发现AOS对新鲜和冷冻精液都为有效的稳定性增强剂。因此，本发明一个目的是提供新的方式以延长用于人和其它动物的辅助生殖过程的精液的功能寿命，或至少提供对现有方法的有效替代方式。

发明内容

在一方面本发明提供丙二烯氧化物合酶作为精液的保存剂的用途。该丙二烯氧化物合酶可为源自银胶菊橡胶植物灰白银胶菊的丙二烯氧化物合酶，或可由银胶菊橡胶植物灰白银胶菊的丙二烯氧化物合酶克隆。该丙二烯氧化物合酶优选具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或为其功能等价的变体。

丙二烯氧化物合酶可为适于使用的任何形式，例如适于在pH-缓冲的水性介质中使用的形式。该丙二烯氧化物合酶可以任何合适的浓度(例如1至10μg/ml)存在于介质中。

在本发明一些实施方案中，所述精液为牛精液。在本发明的一些其它实施方案，该精液为人精液。在其它实施方案中，该精液可源自马、羊、猪或家禽。

在第二方面本发明提供延长精液的寿命的方法，其通过将精液与丙二烯氧化物合酶接触。通常，所述精液在丙二烯氧化物合酶的存在下储存。