[发明专利]一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法。

背景技术

谷胱甘肽转移酶(GSTs)具有多种催化活性：可以将还原型谷胱甘肽(GSH)共价偶联到含有亲电子碳、氮、硫原子的非极性化合物上，从而使GSTs做为中心元件参与到药物、农药及其它异源物质的代谢去毒过程；GSTs还可以催化还原一些氧化胁迫的代谢产物，如过氧化物等，从而使得GSTs在防御病菌侵染和非生物胁迫中发挥重要的作用。因此，在很多植物研究中都将GSTs活性作为一个重要指标来评价植株的生长状态和胁迫反应特性。

GSTs活性的分析方法以CDNB偶联活性的分析为主，目前文献上的一些方法在CDNB和GSH使用量上的差异较大，且CDNB多是溶于乙醇或乙醇/水溶液中。事实上CDNB在乙醇中的溶解度较低，更难溶于乙醇/水溶液中，因此有些文献中CDNB的使用量实际上是较难达到的，且乙醇加多会引起蛋白变性；另外高CDNB和GSH含量时本底反应较高，会掩盖酶催化反应；还有一些方法需要对全蛋白提取液进行进一步的操作以提高GSTs的蛋白含量。这些方法在实验中的实际操作性较低。本发明在现有分析方法的基础上，通过反复实验，确定了一个适用于植物全蛋白提取液的CDNB偶联活性分析方法。

发明内容

本发明提供的一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，该方法通过反复实验，选择适用于植物全蛋白提取液的CDNB偶联活性分析方法实现的。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以烟草叶片或根的全蛋白提取液为样品，同时以提取液为对照样，以GSH和CDNB为反应底物，通过测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。

所述全蛋白提取液为非变性提取液。

所述GSTs活性分析方法的反应体系，按顺序在一个比色皿中依次加入50～200μl提取的全蛋白、1～4μlGSH和0.1～0.4μlCDNB，并加入缓冲液至100～400μl。

所述CDNB用丙酮溶解，浓度为0.1-1.5M。

所述反应体系中GSH与CDNB的摩尔浓度比大于2。

所述GSH用全蛋提取液溶解，浓度为40mM-200mM。

所述植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，作为筛选高GSTs活性优良植株、除草剂的应用。

本发明的有益效果：改进后的方法将CDNB的溶剂由乙醇改为丙酮，大大提高了CDNB的溶解性，在同样CDNB浓度下降低了溶剂的使用量，从而避免了由过量溶剂引起的蛋白变性；同时，改进后的方法增加了谷胱甘肽(GSH)与CDNB的摩尔比，使其更有利于分析GSTs蛋白含量较低的植物全蛋白提取液。

附图说明

图1为烟草幼苗根和叶片的GSTs活性；

图2为不同品种玉米叶片的GSTs活性；

图3为不同品种玉米根的GSTs活性；

图4为不同农药对烟草根中GSTs活性的影响；

图5为不同农药对烟草叶片中GSTs活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。

实施例1

比较烟草根和叶片GSTs活性分析方法的应用

试剂的配制：称取0.20255克CDNB(分子量为202.55)溶于1ml丙酮，配成1MCDNB溶液，冻存于-20℃；称取0.61466克还原型谷胱甘肽(GSH，分子量为307.33)溶于10ml提取液中，配成200mMGSH溶液，每份1ml冻存于-20℃，用前取出一份于冰上融化。

材料的准备：以生长至6叶龄的烟草叶片和根为材料，采集完全展开的第三、四位叶片，称重后使用；用清水洗净根部的土壤，滤纸吸干水分，称重待用。

全蛋白提取液(粗提液)的制备：使用pH为7.5的磷酸缓冲液(不含尿素)按照1：3(w/v)的比例加入烟草叶片或根中，冰浴研磨至匀浆，14000×g、4℃离心15min，上清即为烟草叶片或根的全蛋白粗提液，冰浴放置。